Resistensbestemmelse av
anaerobe bakterier
Truls Leegaard
AFA-kurs 2015
Anaerober - utfordring
•
•
•
•
•
•
Langsomtvoksende
Identifikasjon
Krever spesielle vekstvilkår
Opprettholdes anaerobe forhold?
Hvilke funn skal resistensbestemmes?
Polymikrobielt
Hva skal vi resistensbestemme?
• Viktig å identifisere anaerober korrekt – har tradisjonelt
vært vanskelig
• Dermed risikerer man å sammenligne resistensen til
forskjellige grupper
• Nå endelig mulig, med:
– MALDITOF MS matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry
– 16S RNA
• NORM 2014: Standardisering av identifikasjon og
resistensbestemmelse
Resistensmekanismer
• Penicilliner
• Karbapenemer
– β-laktamase klasse A
(cefalosporinaser)
– Hemmes av tazobactam
og klavulansyre
• Bacteroides
spp.
• Prevotella spp.
• Fusobacterium
spp.
– Metallo-β-laktamase
– cfiA
• Bacteroides
fragilis gruppen
Resistensmekanismer
• Klindamycin
– Metylaser
– Høygradig, konstitutiv
MLS-resistens
• Bacteroides spp.
• Peptostreptococcus
spp.
• Metronidazol
– nim-gener (nitromidazol
reduktase)
Referansemetode:
Agar-fortynning (CLSI) / Buljongfortynning (B.fragilis
gruppen)
Anbefalt metode:
Agar gradientdiffusjon
• Medium:
– Brucella agar med
• 5 % saueblod
• 1 mg/L vitamin K1
• 5 mg/l hemin
• Inokulum:
– Brucella-buljong (eller tilsvarende)
– 1 McFarland (3 McF for C. difficile)
Agar gradientdiffusjon
• Inkubering
– Inkuberes innen ”1 – 2 timer”
– Anaerob atmosfære (4-7 % CO2)
– 20-24 timer ( - 48 timer)
Supplerende tester
• Nitrocefintest
– Påvisning av β-laktamaser
– Som regel positiv innen 30 minutter
• MBL-kombinasjonsstrips
Tolkning
• S-I-R-kategorisering iht brytningspunkttabell
Nitrocefin +
R for penicilliner
Nitrocefin -
MIC?
MIC > S
ID?
Repeter test
Peptostreptokokker
Erythromycin
MIC > 8 mg/L
R for Klindamycin
Bacteroides
Erythromycin
MIC > 32 mg/L
R for Klindamycin
MIC > S
ID?
Repeter test
Penicilliner
Karbapenemer
Klindamycin
(Induserbar resistens)
Metronidazol
Kvalitetskontroller
• Anbefales inkludert ved hvert oppsett
– B. fragilis (ATCC 25285) - metronidazol
– P. aeruginosa (ATCC 27853) på laktose agar
Hvilke midler bør være med i et
resistensoppsett?
•
•
•
•
•
•
•
Penicillin
Piperacillin-tazobactam
Meropenem
Klindamycin
Metronidazol
(Kloramfenikol)
Brytningspunkter fra Eucast/NordicAST/AFA:
www.nordicast.org
Resistensbestemmelse av anaerober i Norge
• Kommedal O, Nystad TW, Bolstad B, Digranes A. Antibiotic
susceptibility of blood culture isolates of anaerobic bacteria at a
Norwegian university hospital. APMIS. 2007; 115: 956-61
• Hannula R, Iversen G. Resistance of Bacteroides species in
Trondheim, Norway. Poster ECCMID 2008. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=hannula+2008
• N Handal, SB Jørgensen, HS Tunsjø, BO Johnsen, TM
Leegaard. Anaerobic blood culture isolates in a Norwegian
university hospital: identification by MALDI-TOF MS vs 16S
rRNA sequencing and antimicrobial susceptibility profiles.
APMIS 2015; 123: 749-58
• NORM rapport 2014: www.antibiotikaresistens.no
Kilder
• NordicAST metodedokument:
“Resistensbestemmelse af anaerobe
bakterier”. NordicAST 2012.
• Strategirapport nr. 23, 2009 – “Anaerob
diagnostikk”. FHI 2010.
• M11-A8 – Methods of Antimicrobial
Susceptibility Testing of Anaerobic
Bacteria; Approved Standard – Eight
edition. CLSI 2012.
Identifikasjon
• For å få en god oversikt over resistensforholdene er
det essensielt at identifikasjonen er korrekt.
• Artikkelen sammenligner MaldiTOF identifikasjon
med 16S identifikasjon
• Viser at MaldiTOF fungerer godt, med unntak av
GPAK og non-fragilis bacteroides group pga dårlige
databaser hos produsenten.
• Fusobacterier må forbehandles for å få akseptabel
identifikasjon
• Pga utbredelsen av MaldiTOF er nå overvåkning av
anaerob resistens mulig
Hvilke resistens kan jeg finne i mitt eget
laboratorium?
•
•
•
•
•
•
•
Resistens mot β-laktam + β-laktamase inhibitor kombinasjoner er vanlig i
Bacteroides fragilis gruppen
Resistens mot metronidazol på grunn av nim gener. Sjeldent, men er påvist
over hele verden og det er også påvist overføring til andre arter. PCR
påvisning av nim gener er ikke tilstrekkelig for å påvise resistens mot
metronidazol, man må utføre en MIC bestemmelse, noe som tyder på at
nim alene ikke er nok til å gi metronidazol-resistens
Klindamycin resistens (20% av alle anaerobe bakterier)
Beta-laktamaseproduksjon i 2/3 av Prevotella isolatene
Penicillinaseproduksjon i Fusobacterium og Clostridium butyricum
Bred-spektrum beta-laktamase hos Clostridium clostridioforme og
Clostridium ramosum
Karbapenemase produksjon hos B. fragilis (3%)
Bacteroides fragilis (n=74)
%R
0,064 0,125 0,25 0,5
1
2
4
8
16
32
Metronidazol
1.4
0
2
9
32
29
0
1
0
0
1
Penicillin
100
0
0
0
0
0
2
5
6
37
24
Pip-tazo
2.7
2
4
18
33
11
1
2
1
2
0
Meropenem
6.8
6
45
13
5
0
0
1
1
2
1
Klindamycin
12.2
5
6
7
14
15
10
8
0
0
9
Non-fragilis Bacteroides spp. (n=48)
%R
0,064 0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
Metronidazol
2.1
0
0
2
23
20
2
0
0
0
1
Penicillin
97.9
0
0
1
1
2
2
3
4
12
23
Pip-tazo
43.7
0
0
2
1
3
6
7
8
15
6
Meropenem
2.1
0
11
29
7
0
0
1
0
0
0
Klindamycin
29.2
6
1
4
3
4
9
7
4
1
9
Fusobacterium spp. (n=13)
%R
0,064
0
11
0
2
Penicillin
15.4
10
1
Pip-tazo
0
13
Meropenem
0
Klindamycin
0
Metronidazol
0,125 0,25 0,5
1
2
4
8
16
32
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
13
0
0
0
0
0
0
0
0
0
13
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Gram-positive anaerobic cocci (n=15)
%R
0,064 0,125 0,25 0,5
1
2
4
8
16
32
Metronidazol
0
2
4
3
3
0
3
0
0
0
0
Penicillin
0
12
2
1
0
0
0
0
0
0
0
Pip-tazo
0
11
1
1
1
0
1
0
0
0
0
Meropenem
0
13
1
1
0
0
0
0
0
0
0
Klindamycin
20
3
3
3
1
2
0
0
0
0
3
Prevotella spp. (n=13)
%R
0,064 0,125 0,25 0,5
1
2
4
8
16
32
Metronidazol
15.4
0
3
2
0
3
3
0
1
0
1
Penicillin
69.2
3
1
0
2
1
0
1
3
2
0
Pip-tazo
0
9
3
0
1
0
0
0
0
0
0
Meropenem
0
9
4
0
0
0
0
0
0
0
0
Klindamycin
0
12
0
1
0
0
0
0
0
0
0
Clostridium spp. (n=32)
%R
Metronidazol
0,064 0,125 0,25 0,5
1
2
4
8
16
32
0
2
1
3
3
9
10
4
0
0
0
Penicillin
34.4
13
7
1
2
6
1
1
0
1
0
Pip-tazo
3.1
16
5
1
0
4
1
1
3
1
0
Meropenem
0
18
1
1
5
7
0
0
0
0
0
Klindamycin
31.3
6
3
1
4
2
3
3
6
1
3
B. fragilis
Penicillin: R
Pip-tazo: R
Meropenem: R
Metronidazol: R
Klindamycin: R
Kloramfenikol: S
Pasient fra
Pakistan
B. thetaiotaomicron
Penicillin: R
Pip-tazo: R
Meropenem: S
Metronidazol: S
Klindamycin: S
Kloramfenikol: S
P. bivia
Penicillin: R
Pip-tazo: S
Meropenem: S
Metronidazol: 2 (S) -> 8 (R)
Klindamycin: S
Kloramfenikol: S