栗林・佐藤・三澤：金ナノ粒子を用いた放射線治療用増感剤に関する基礎的検討金ナノ粒子を用いた放射線治療用増感剤に関する基礎的検討栗林翔太1）　佐藤昌憲1）　三澤雅樹2） 1）駒澤大学医療健康科学研究科 2）（独）産業技術総合研究所ヒューマンライフテクノロジー研究部門概要癌治療の中でも放射線治療は侵襲性の低い治療として知られており、関心が高まっている。現在放射線治療の主流となっている低 LET 放射線を用いた治療法は、人体中の水と放射線が相互作用を起こし、ヒドロキシラジカルやスーパーオキシド、一重項酸素といった活性酸素種を発生させ、DNA の損傷を促すものである。しかしがん自体の放射線感受性、がんの存在する環境などから、すべてのがんに放射線治療が適用できるわけではない。治療効果を高める方法の一つとして、放射線治療用増感剤を用いる方法がある。増感剤は低酸素環境の改善や、DNA 損傷の増強により、治療効果を向上させるのだが、人体への副作用や腫瘍のみに特異的に集積させられるものがなく、ほとんど臨床の現場では使用されていない。新規増感剤として、金ナノ粒子に注目が浴びている。金ナノ粒子は金原子がクラスタ状に形成されたもので、X 線照射による相互作用がキレート剤のような一様に原子が分布している状態よりも多く起こる。また、金ナノ粒子は表面修飾が容易で腫瘍細胞へ特異的に集積させることが可能であり、また金自体が人体に無害であることが知られていることから、増感剤として期待されている。本研究では粒径の調整された金ナノ粒子に診断領域の X 線および治療領域の X 線、電子線を照射して活性酸素発生量と腫瘍細胞生存率を測定し、金ナノ粒子の放射線増感効果を確認した。活性酸素発生量については AminoPhenyl Fluorescein で蛍光量を測定した。診断領域の放射線では通常時より約 6 倍、治療領域では 5～9 倍の活性酸素が発生していた。また、濃度、線量依存性があり、粒径依存性は見られなかった。細胞生存率は Colony Forming Unit をカウントし、LQ モデルを作成して比較した。金ナノ粒子を含んだ細胞は培地のみに比べて診断領域で 1.23、治療領域で 1.44 倍細胞生存率が低下した。今回の結果から、金ナノ粒子による放射線増感効果は有用なものであり、今後の研究により、現場利用が可能と考えられる。 1．背景性、低酸素環境等、条件によっては適用できない日本におけるがん罹患数は約 80 万人で、その場合がある。これを解決する方法の一つが放射線多くが 60 代以上と高齢であり、負担の大きい外治療用増感剤であり、従来の放射線治療用増感剤科的切除、副作用の大きい化学療法では患者が耐の多くは DNA の損傷を強めたり、低酸素環境をえられない場合もある。一方患放射線治療の適用改善したりするものであったが、副作用が大き率は 2009 年時点で 27.6％と、米国の 66.6％と比く、臨床利用には至らなかった。その他に、高原較すると低い値となっているが、患者への負担が子番号の物質を主要組織内に集積させ、増感させ少ないことから、年々適用率が増加している1）。る方法もあり、国内では松平氏のヨウ素を用いた負担の少ない放射線治療であるが、正常組織と放射線増感効果についての論文がある。がんの位置関係、またはがん自体の放射線抵抗近年、金ナノ粒子のエレクトロニクス特性につ ─ 27 ─ 駒澤大学医療健康科学部紀要　第 12 号（2015）いての研究が進み、治療薬、生物医学用ドラッグに反応する。デリバリーなどのハイテク分野で利用されるよう一重項酸素は化学式 1O2 で示され、酸素分子のになった。2）ヨウ素よりも原子番号が高く、生体全スピン量子数が 0 で、励起状態となったもので整合性も良い金のナノ粒子は、放射線増感剤としある。寿命は 2 μs と非常に短く、生体内ではβ─ て様々な論文報告がされているが、現時点では研カロテン、ビタミン B2、ビタミン C、ビタミン究段階である。 E、尿酸などにより除去される。これらは生命活動を行う際に体内で発生してい 2．目的るが、X 線やγ線などの電離放射線と水や酸素と金ナノ粒子の粒径、濃度を変化させて、診断領の相互作用によっても発生する。細胞の主成分は域の X 線及び治療領域の X 線、電子線を照射し水であるので、生体に X 線やγ線を照射するとた際の活性酸素（Reactive Oxygen Species : 細胞内で ROS が発生し、DNA や細胞膜に損傷 ROS）発生量を測定し、また子宮頸癌細胞であを与えることができる。る HeLa 細胞に金ナノ粒子を取り込ませ、同様に 3． 2　金ナノ粒子放射線を照射し、生存率測定を行うことにより金金ナノ粒子の歴史は古く、教会のステンドグラナノ粒子の増感効果確認を目的とした。スなど芸術分野で広く使われている。調製方法については 1857 年に Michael Faraday が報告して 3．理論いる。2）顕微鏡技術の進歩により、金ナノ粒子を 3．1　活性酸素直接画像化できるようになり、金ナノ粒子の粒径現在放射線治療の主流となっている低 LET 放調整や表面の保護が可能となった。金ナノ粒子は射線を用いた治療法は、人体中の水と放射線が相表面プラズモン共鳴（SPR : Surface Plasmon 互作用を起こし、ヒドロキシラジカルやスーパー Resonance）により、可視光周波数と共鳴するよオキシド、一重項酸素、過酸化水素といった活性 2）うな協奏的振動を電荷に引き起こす。粒径が小酸素種を発生させ、DNA の損傷を促す間接作用さい場合、青から緑のスペクトル（約 450 nm）を主に利用したものである。が吸収され、赤色（700 nm）が反射されるため、スーパーオキシドは化学式 O2・で示され、酸赤みがかった発色となる。粒径が大きくなると、素分子が 1 つの不対電子を持つものである。寿命共鳴波長は長波長側にシフトする。波長スキャンは 5 s 程度であり、生体内で発生した O2・はスーのグラフを Fig. 1 に示す。パーオキシドディスムターゼ（SOD）と呼ばれる酵素で酸化還元を経て過酸化水素に変化する。この過酸化水素はカタラーゼやグルタチオンペルオキシターゼで無害化されるが、生体中の微量金属イオンの Fe2＋や Cu＋とフェントン反応を起こし、ヒドロキシラジカルを産生する。ヒドロキシラジカルは化学式 OH・で示され、 ROS の中でも極めて反応性が高く、ROS による生物作用の大部分を占めるとされている。OH・の寿命は 200 μs 程度で、発生箇所近傍にある糖や脂質、タンパク質、DNA などの分子と無差別 ─ 28 ─ Fig. 1　Gold nanoparticles absorbance scan 栗林・佐藤・三澤：金ナノ粒子を用いた放射線治療用増感剤に関する基礎的検討金ナノ粒子の合成は、蒸留水にテトラクロロ金（Ⅲ）酸（HAuCl4）を加え、攪拌しながらクエン酸やアスコルビン酸などの還元剤を添加して還元する還元法が一般的である。粒径の調製は還元剤の量により溶媒の pH を変化させることで調整できる。金ナノ粒子の医療分野での応用は、金ナノ粒子に 700～800 nm の近赤外線を当てることで粒子に熱を生成させ、腫瘍を除去する光線力学的療法 Fig. 2　Mass attenuation coefficient of Gold and Soft Tissue （PDT : Photodynamic Therapy）、金ナノ粒子の表面積の大きさを利用した治療用薬物送達システ 3． 3　蛍光試薬 APF ム（DDS : Drug Delivery System）、診断用 CT ROS の検出には ESR が一般的であるが、X 線造影剤、家庭用妊娠検査薬など多岐にわたる。照射条件下では測定ができないため、照射後に金ナノ粒子を体内に入れるときは、その粒径を ROS の積算量を測定する蛍光試薬を採用した。 100 nm 以下にすると、体循環中に肝臓の細網内 APF（AminoPhenyl Fluorescein）は中性水溶液彼系補足されずに循環でき、正常組織に比べ血管中では蛍光をほぼ持たないが、ROS と反応する透過性が著しく亢進している腫瘍組織に蓄積しやと強蛍光性化合物フルオレセイン（励起波長 490 すくなる（EPR 効果）。この EPR 効果と、金ナ nm、蛍光波長 515 nm）を生成し、蛍光強度によノ粒子の表面に腫瘍細胞へ取り込まれやすい抗体。4）り ROS 発生量を測定できる（Fig. 3）を修飾することにより、腫瘍細胞に金ナノ粒子を特異的に取り込ませることが出来る。金は正常軟組織に比べ原子番号が高く（Fig. 2）、X 線の減弱が大きい。金ナノ粒子に放射線を照射すると、光電効果やコンプトン効果などの相互作用が起こり、二次電子や二次放射線が大量に生じる。水分子や酸素が存在する条件下で金ナノ粒子を加えて照射すれば、二次電子や二次放射線 Fig. 3　chemical change formula of APF と相互作用を起こし、大量の ROS が発生すると考えられる。 3． 4　細胞生存率細胞生存率の測定は、放射線照射後のコロニー形成（CFU : Colony Forming Unit）をカウントする方法が一般的であるが、今回は処理するプレート量の関係でウエル内の細胞占有率から求めた。各線量の生存率プロットから直線 ─ 二次曲線（LQ : Linear Quadratic）モデルを作成した。このフィッティングからα値、β値を求めた。1 粒子による 2 本差切断の発生率をαとし、2 粒子による 1 本差切断が近距離にあり 2 本差切断を起 ─ 29 ─ 駒澤大学医療健康科学部紀要　第 12 号（2015） Table 1　Gold nanoparticles parameter Diameter ［nm］ Coefficient of Variation No. particles ［/mL］ Mass of Au ［/mL（μg）］ Conc. ［μM］ Zeta potential ［mV］ 5 ＜15％ 5.0×1013 63.2 321 －38.6 20 ＜8％ 7.0×1011 56.6 287 －41.1 40 ＜8％ 9.0×1010 58.2 295 －44.0 60 ＜8％ 2.6×1010 56.8 288 －50.2 80 ＜8％ 1.1×1010 56.9 289 －52.8 こす率をβの平方根とすると、αは線量 D に比 5．方法例し、 β は D 2 に比例するので致死率は αD＋ 5． 1　ROS 発生量測定 βD 2 となる。したがって生存率を S とすると、 Table 1 で示した粒径の金ナノ粒子を蒸留水で 2 S＝exp［−（αD＋βD ）］ …（1） 5） 2、4、8 倍に希釈して、96 穴プレートの各ウエルとなる。生存率曲線下の面積（AUC : Area Un- に 100 μL 加えた。このとき、標準偏差を算出す der Curve）を台形近似から求めて、細胞を不活るために各パラメータ 3 ウエル作製した。各ウエ性化する平均線量（MID : Mean Inactivation ルに 5 μM に調整した APF を 50 μL 加えた。次 Dose）とした。本研究では培地のみの環境で培に、100 kV X 線を 3 Gy、10 MV X 線、9 MeV 養した HeLa 細胞に金ナノ粒子を加えて培養した電子線を 2 Gy ずつ 8 Gy まで照射した。照射前後 HeLa 細胞の MID の比を感度増感比率（SER : の蛍光量を測定し、その差分から ROS 発生量を Sensitizer Enhancement Ratio）として求めた。算出した。照射条件を Table 2、実験配置図を Fig. 3 に示す。 4．使用機器 Table 2　ROS generation test ▪金ナノ粒子：5, 20, 40, 60, 80 nm（BBI Solution） ▪培地：MEM ▪蛍光プレートリーダ（Promega : GloMax） ▪診断用 X 線装置：（東芝：KXO─15E）100 kV、 4 mA、0.53 mGy/min. Beam Energy Xray 100 kV Xray 10 MV Electron 9 MeV Diameter ［nm］ Conc. ［mM］ 0.14 5, 20, 40, 60, 80 0.07 0.04 ▪医療用 Linac：（三菱：EXL─15SP）10 MV、1.0 Gy/min. Xray、9 MeV、2.0 Gy/min. Electron 5． 2　細胞生存率測定 ▪タフウォーターファントム：京都科学 5． 2． 1　細胞培養 ▪蛍光試薬 APF 各粒径金ナノ粒子を培地で 2、3 倍希釈し、 ▪ 96 穴プレート HeLa 細胞を 1.3×104 個/mL の濃度で 6 穴プレー ▪ 6 穴プレートトに 2 mL ずつ播き、24 時間培養した。コントロ ▪解析ソフト：ImageJ、MATLAB ver. 6.0 ールとして、金ナノ粒子を含まない培地のみのウエルも同様に培養した。 ─ 30 ─ 栗林・佐藤・三澤：金ナノ粒子を用いた放射線治療用増感剤に関する基礎的検討 Fig. 4　Irradiation Setup 5． 2． 2　放射線照射る。 100 kV X 線で 0、1、2、3、4、5 Gy まで、10 6． 2　ROS 発生量測定 MV X 線で 2 Gy ずつ 8 Gy まで、9 MeV 電子線各パラメータで得られた結果を Fig. 6～Fig. 12 で 4 Gy 照射した。なお、照射条件を Table 3 にに示す。粒径 20、40、60、80 nm では、100 kV 示す。 X 線、3 Gy で 5～7 倍、10 MV X 線で 5～8 倍、蒸留水のみよりも ROS 発生量が増加していた。 Table 3　HeLa cell survival fraction test Beam Energy Xray 100 kV Xray 10 MV Electron 9 MeV Diameter ［nm］また、線量依存性も見て取ることが出来る。電子 Conc. ［mM］線と X 線を比較すると、どの線量においても、電子線の方が発生量が多かった。一方、5 nm の 0.14 5, 20, 40, 60, 80 金ナノ粒子では蒸留水よりも ROS 発生量が減少 0.07 していた。線量依存性も見て取れないことから、 0.04 5 nm 金ナノ粒子には ROS に対するスカベンジャー、もしくは APF に対する阻害が働いていると 5． 2． 3　細胞生存率測定考えられる。照射後、9～14 日培養を行い、細胞をメタノー 6． 3　細胞生存率測定ルで 4％に希釈したクリスタルバイオレットで固結果を Fig. 13～Fig. 14 に示す。金ナノ粒子を定、染色を行い、デジタルカメラで撮影した。撮加えると、細胞生存率が培地のみよりも低下して影した画像を ImageJ に取り込み、バイナリ化しいるのが見て取れる。LQ モデルから MID を算て各ウエルの細胞占有率を CFU として測定した。出し、SER を求めた。結果を Table 4 に示す。 6．結果 7．考察 6． 1　細胞培養 7． 1　ROS 発生量測定粒径 40 nm の金ナノ粒子を加えて 24 時間培養結果より、20─80 nm の金ナノ粒子では、濃度した HeLa 細胞と、培地のみで培養した HeLa 細依存的、線量依存的に ROS 発生量が増加してい胞の顕微鏡画像を Fig. 4 に示す。粒状の像がるため、ROS の発生は金ナノ粒子の寄与と考え HeLa 細胞表面や内部に点在しているのが見て取られるが、粒径による依存性は見られなかった。れる。培地のみの画像にはこのような像が見えなこのことから、ROS の発生は金の質量濃度に依いことから、これが金ナノ粒子ということが分か存すると考えられる。このことは、DDS の観点 ─ 31 ─ 駒澤大学医療健康科学部紀要　第 12 号（2015） μm Fig. 6　ROS generation by 100 kV─Xray μm Fig. 4, 5　Gold nanoparticle Agglomeration by Endocytosis Fig. 7, 8, 9　ROS generation by 10 MV─Xray ─ 32 ─ 栗林・佐藤・三澤：金ナノ粒子を用いた放射線治療用増感剤に関する基礎的検討 Fig. 13　Surviving Fraction by 100 kV─Xray Fig. 10, 11, 12　ROS generation by 10 MV─ Xray and 9 MeV Electron Fig. 14　Surviving Fraction by 10 MV─Xray Table 4　MID and SER by 100 kV─Xray Table 5　MID and SER by 10MV─Xray MID SER MID SER 40 nm 1.93 1.23 20 nm 2.95 1.20 MEM 2.38 1.00 40 nm 2.50 1.42 60 nm 3.31 1.07 MEM 3.55 1.00 ─ 33 ─ 駒澤大学医療健康科学部紀要　第 12 号（2015）から腫瘍によって粒径選択を自由に行えて、金ナったのは、ROS 測定はウエル中の水全体が測定ノ粒子の修飾に有利と考えられる。また、5 nm 範囲なのに対し、HeLa 細胞はウエル底面に分布については濃度依存性、線量依存性が見られず、しており、寿命の短い ROS は細胞に作用する前蒸留水よりも発生量が低かった。このことは、先に無害化するため効果範囲が限られていると考え述のように APF に阻害剤として働いたと考えらられる。また細胞中に理論で述べたような ROS れるほかに、金は光子で電子を発生させるために消去機構が存在するため、このような結果になっ 4.9 eV の仕事関数を上回るエネルギーを与える必たと考えられる。要があるが、粒径が小さいと放射線との相互作用 SER は粒径 40 nm にて、100 kV X 線が 1.23、が起こりにくく、二次電子を発生させるのに必要 10 MV X 線が 1.42 であった。これは 100 kV X なエネルギーが得られなかった可能性がある。線がよりよく水中へ吸収されるため、細胞への影響が 10 MV X 線より大きく、培地のみの生存率も落ちたため、金ナノ粒子による ROS 増加の影響が薄かったと考えられる。 10 MV X 線において、SER が最大であったのは粒径 40 nm で、粒径依存性は見られなかった。これは 40 nm が細胞によく取り込まれており、 ROS を効率よく細胞に与えることが出来たためと考えられる。細胞への取り込みは 200～300 nm までの粒径であれば行われるため、今回使用した系は全て細胞に取り込まれると思われる。 Fig. 15　Gold nanoparticles Work Function 8．結論 100 kV X 線と 10 MV X 線で線質による変化金ナノ粒子に X 線を照射すると、診断領域のは、1.3 倍程度、100 kV X 線の方が増加していエネルギーでは水のみに比べ 5～7 倍、治療領域た。これは、100 kV X 線の方がより多く水中ででは 5～8 倍の ROS が発生した。また、HeLa 細吸収され、2 次電子を発生させたためだと考えら胞に金ナノ粒子を加えて照射すると、診断領域のれる。エネルギーでは 1.22 倍、治療領域では 1.07～1.42 また、X 線と電子線を比較すると、電子線の方倍の増感効果が得られた。がより多く ROS を発生させているのが分かる。従って金ナノ粒子による増感効果は有用なものこれは、電子線の相互作用の確率が X 線よりもであり、今後も研究を進めていく必要がある。高いためであると考えられる。ROS 発生のメカニズムには電子が重要な役割を担っており、水と謝辞相互作用をおこして電子を発生させる X 線より本研究を進めるにあたり、様々なご指導を頂きも、入射電子が金ナノ粒子表面を直接散乱させるました独立行政法人産業技術総合研究所の藤田克ことで、電子線の方がより多くの二次電子を発生英様、茨城県立医療大学の布施拓助教に深く感謝させていたと考えられる。致します。 7． 2　細胞生存率 ROS 発生量と比較して生存率の低下が小さか ─ 34 ─ 栗林・佐藤・三澤：金ナノ粒子を用いた放射線治療用増感剤に関する基礎的検討参考文献 1）中川恵一：がん対策基本法施行後の実績と問題点．INNERVISION 26・3，（2011） 2）SIGMA-ALDRICH 社 HP www.sigmaaldrich.com/japan/materialscience/ nano-materials/gold-nanoparticles.html 3）Michael Faraday : The Bakerian Lecture : Experimental Relations of Gold（and Other Metals）to Light. 145─181,（1857） 4）活性酸素検出用蛍光試薬：積水メディカル株式会社 HP　http://www.sekisuimedical.jp/business/adme_ tox/business/pdf/imaging_pdf003.pdf 5）西臺武弘：放射線治療物理学，p. 56（1996） 6）Devika B. Chithrani et al. : Gold Nanoparticles as Radiation Sensitizers in Cancer Therapy ; RADIATION RESEARCH, 173, 719 ─728, （2012） 7）吉川敏一：フリーラジカルの科学；講談社（1997） 8）S Jain et al : Gold nanoparticles as novel agents for cancer therapy ; The British Journal of Radiology, 85, 101─113,（2012） . 9）Jack Simons : How Do Low-Energy（0.1─2 eV）Electrons Cause DNA-Strand Breaks? ; Acc. Chem. Res. 39, 722─779（2006） 10）Masaki Misawa, Junko Takahashi : Generation of reactive oxygen species induced by gold nanoparticles under x-ray and UV Irradiations ; Nanomedicine. 7, 604─614,（2011） ─ 35 ─ 駒澤大学医療健康科学部紀要　第 12 号（2015） ABSTRACT As radiation therapy in cancer treatment is known as a low-invasive therapy, it is receiving increasing attention. Radiation therapy using low-LET radiation is currently the mainstream of radiation therapy. Water in human body interacts with radiation, it is intended to promote the damage of DNA to generate reactive oxygen species as hydroxyl radical, superoxide and singlet oxygen. However, radiation therapy is not applicable to all cancers due to radiosensitivity and existing environment. One way to enhance the treatment effect using a radiation therapy sensitizer. It improves the treatment effect by improvement of low-oxygen environment and enhancing DNA damage, but it is not the most clinical site is used because of side effects and cannot specifically accumulate in tumor only. Recently, gold nanoparticles have attracted attention as a new sensitizer. Gold nanoparticles of atoms interaction by which X-ray irradiation is formed in the shape of clusters are generated more than chelating agents. Furthermore, gold nanoparticles can be specifically integrated into the tumor cells and can easily modify the surface. Also the fact that gold is non-maleficence to the human has been known for a long time, so it is expected as a sensitizer. In this study, by irradiating gold nanoparticles with diagnostic X-ray, treatment X-ray and electron beam, the active oxygen generation amount and the tumor cell viability was measured to confirm the radiation sensitizing effect of gold nanoparticles. We have measured amount of active oxygen generation using AminoPhenylFlourescein. About 6 times more than normal at the time of radiation of the diagnostic Xray, 5─9 times the active oxygen has increased in the treatment Xray. It is concentration-dependent and dose-dependent, but not particle size dependent. Cell viability was evaluated by LQ model by counting the ColonyFormingUnit. Cell viability is 1.23 times in diagnostic Xray, 1.44 times in treatment Xray, decreased as compared to the medium only. Our results show that radiosensitization effects of gold nanoparticles are merely useful, in future research. I considered it possible in field use. ─ 36 ─