‫דגים במחקר הביו‪-‬רפואי‬ ‫‪-------------------------------‬‬‫דר' יפעת עוזי‬ ‫‪DVM‬‬ ‫‪1‬‬ ‫מידע כללי וטקסונומיה‬ ‫ העתיקה‬,‫דגים – מונח רחב המתייחס לקבוצה הטקסונומית הגדולה‬ .‫והמגוונת ביותר בקרב בעלי החוליות‬ :(classes) ‫ מחלקות‬4 -‫הדגים הקיימים כיום מחולקים ל‬ Superclass Agnatha - Vertebrates without jaws: Class Myxini (hagfish) Class Cephalaspidomorphi (lampreys) Superclass Gnathostomata - Vertebrates with jaws Class Chondrichthyes / Elasmobranchiomorphi (cartilaginous fish – sharks and rays) Class Osteteichthyes / Teleostomi (bony fish) – two subclasses: • Actinopterygii (ray-finned fish) • Sarcopterygii (lobe-finned fish) 2 ‫מידע כללי ‪ -‬המשך‬ ‫כיום מוכרים למעלה מ‪ 30,000 -‬סוגי דגים‪.‬‬ ‫הרוב הגדול )כ‪ (23,000 -‬שייך למחלקת דגי העצם‪.‬‬ ‫מחלקה זו בלבד מכילה יותר סוגים מאשר יש בקרב‬ ‫יונקים‪ ,‬ציפורים‪ ,‬זוחלים ודו‪-‬חיים ביחד‪.‬‬ ‫ההבדלים האנטומיים והפיזיולוגיים בין הסוגים הינם‬ ‫משמעותיים כמו הבדלים בין סוגי יונקים‪ ,‬הדבר מאפשר‬ ‫לחוקרים התמקדות ויצירת מודלים אנטומיים‪ ,‬פיזיולוגיים‬ ‫או מודלים של מחלות‪.‬‬ ‫‪3‬‬ ‫אנטומיה ומאפיינים בסיסיים בדגי עצם‬ ‫‪4‬‬ 5 ‫מאפיינים ‪ -‬המשך‬ ‫אברי הרבייה כוללים אשכים בזכר ושחלות בנקבה‪.‬‬ ‫יש דגים דימורפיים ומונומורפיים‪ .‬גם במונומורפיים ניתן‬ ‫להבדיל בין זכר לנקבה ע"י הפפילה הגניטלית )גדולה‬ ‫יותר בנקבות(‪.‬‬ ‫‪6‬‬ ‫שימוש במחקר‬ ‫דגים הם מודל חיה חדש יחסית במחקר אך הפופולאריות‬ ‫שלהם צוברת תאוצה בשנים האחרונות‪.‬‬ ‫נתונים לגבי שימוש בדגים בארץ‪:‬‬ ‫‪7‬‬ ‫שנה‬ ‫מספרים‬ ‫אחוזים‬ ‫‪2000‬‬ ‫‪560‬‬ ‫‪0.23‬‬ ‫‪2004‬‬ ‫‪6231‬‬ ‫‪1.96‬‬ ‫‪2008‬‬ ‫‪20,548‬‬ ‫‪6.33‬‬ ‫‪2009‬‬ ‫‪31,881‬‬ ‫‪10.15‬‬ ‫שימוש במחקר ‪ -‬המשך‬ ‫השימושים העיקריים הם במחקרי פיזיולוגיה בסיסית‪,‬‬ ‫ביולוגיה התפתחותית בחולייתנים‪ ,‬ביוכימיה‪ ,‬ביולוגיה‬ ‫מולקולרית‪ ,‬גנטיקה וטוקסיקולוגיה‪.‬‬ ‫יתרונות הדגים כחיית מחקר הם הגודל )בע"ח קטן‬ ‫ומאפשר החזקת כמות גדולה פר שטח(‪ ,‬הזמינות‪ ,‬המחיר‬ ‫הזול יחסית‪.‬‬ ‫‪8‬‬ ‫רבגוניות‬ ‫‪9‬‬ ZEBRAFISH 10 ZEBRAFISH Danio rerio Scientific classification Kingdom: Animalia Phylum: Chordata Class: Actinopterygii Order: Cypriniformes Family: Cyprinidae Genus: Danio Species: D. rerio 11 ‫דגי זברה – מידע כללי‬ ‫דגי הזברה הם דגי מים מתוקים‪ .‬שמקורם בטבע בנהרות‬ ‫בדרום מזרח הרי ההימלאיה‪ ,‬בהודו‪ ,‬פקיסטאן ונפאל‪.‬‬ ‫אורכו של דג הזברה יכול להגיע עד ל‪ 6-‬ס"מ‪) .‬בשבי‬ ‫בדר"כ לא עולים על ‪ 4‬סמ'(‪ .‬גוף הדג מאורך‪ ,‬דמוי כישור‪,‬‬ ‫פחוס לטרלית‪ ,‬הפה מכוון כלפי מעלה‪.‬‬ ‫לדג חמישה פסי פיגמנטציה כחולים אחידים הנמשכים‬ ‫מראשו ועד זנבו‪.‬‬ ‫ניתן להבחין בדימורפיזם קל‬ ‫במין זה‪.‬‬ ‫‪12‬‬ ‫דגי זברה – מידע כללי ‪ -‬המשך‬ ‫דגי זברה הינם אוכלי כל – אומניבורים‪ ,‬ובעיקר אוכלים‬ ‫זואופלנקטון‪ ,‬חרקים‪ ,‬סרטנים קטנים וכד'‪.‬‬ ‫משך החיים בשבי – ‪ 2-3‬שנים‪.‬‬ ‫משך דור ממוצע הוא ‪ 3-4‬חודשים‪.‬‬ ‫חייבת להיות נוכחות של זכר כדי שתהיה הטלת ביצים‬ ‫ע"י הנקבה‪ .‬ביצים לא מופרות יפסיקו להתפתח אחרי‬ ‫מספר קטן של חלוקות‪ .‬ביצים מופרות יהפכו כמעט מיד‬ ‫לשקופות‪.‬‬ ‫‪13‬‬ ‫דגי זברה – מידע כללי ‪ -‬המשך‬ ‫הרבייה בדגי הזברה אינה עונתית‪ .‬מספר הביצים‬ ‫לתטולה גדול ולרוב נע בין ‪ 150-400‬ביצים‪.‬‬ ‫ההטלות מתרחשות במרווח של ‪ 5-45‬ימים‪ ,‬כאשר‬ ‫המרווח האופטימלי בין התטולות הוא ‪ 5-10‬ימים‪.‬‬ ‫ההטלה מושפעת מאור‪ .‬זמן ההטלה הוא עם אור ראשון‪,‬‬ ‫מחזור אופטימלי הוא ‪ 13‬שעות הארה ו‪ 11-‬שעות חשיכה‪.‬‬ ‫בקיעה – בין ‪ 48-72‬שעות אחרי הפרייה בתלות במצב‬ ‫העובר ובטמפ' המים )אופטימלית – ‪.(28.5‬‬ ‫שחיה ואכילה מתחילים כ‪ 72 -‬שעות אחרי ההפרייה‪.‬‬ ‫‪14‬‬ ‫דגי זברה במחקר‬ ‫השימוש בדגי זברה במחקר התחיל בשנות ה‪ 70 -‬ע"י‬ ‫‪ George Streisinger‬מאוניברסיטת אורגון‪ ,‬בתחום‬ ‫הגנטיקה שגילה שהם יכולים לשמש כמודל של בעל‬ ‫חוליות לבידוד של מוטציות בסקירה גנטית‪.‬‬ ‫‪15‬‬ ‫דגי זברה כחיית מודל‬ ‫מאפייני המודל ויתרונותיו‪:‬‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫‪16‬‬ ‫קטנים )כמות גדולה של דגים בשטח קטן(‪.‬‬ ‫נוחים לגידול ‪ -‬דורשים טיפול מינימלי‪.‬‬ ‫מגיעים לבגרות מינית בזמן קצר יחסית – ‪ 2-4‬חודשים‪.‬‬ ‫הנקבה מטילה מאות ביצים בכל הטלה ויכולה להטיל‬ ‫במרווח זמן קטן‪.‬‬ ‫העוברים מתפתחים מחוץ לאם‪.‬‬ ‫העוברים שקופים מהשלב הראשון לאחר ההפרייה‪.‬‬ ‫קצב ההתפתחות העוברית מהיר מאד‪.‬‬ ‫הגנום של דג הזברה הוא כמחצית הגודל של יונקים‪.‬‬ 1 cell 2 cell 4 cell 8 cell early blastula late blastula mid-blastula 24 hour gastrula stage 17 one day three day embryos two day newly hatched three-day fish http://www.youtube.com/watch_popup?v=moL5C8SjeJU ‫שיטות נפוצות במחקר בדגי זברה‬ ‫גנטיקה –‬ ‫ביצוע סריקות גנטיות מהירות ובקנה מידה גדול‬ ‫בהשוואה לכל חיית מעבדה אחרת מבעלי חוליות‪.‬‬ ‫שני יתרונות למודל של דגי הזברה במחקר התפתחות‬ ‫חולייתנים – קל יחסית לגרום בהם למוטציות וקל לבצע‬ ‫בהם סריקה גנטית‪.‬‬ ‫שתי שיטות לסריקה‪ -‬השיטה המסורתית של רבייה‬ ‫רגילה ושיטה של יצירת עוברים הפלואידים‪.‬‬ ‫‪19‬‬ 20 ‫שיטות נפוצות במחקר בדגי זברה‬ ‫אמבריולוגיה –‬ ‫בדר"כ השתמשו בביציות של דו‪-‬חיים )גדולות ומתפתחות‬ ‫חוץ גופית(‪.‬‬ ‫נכון גם לדגי זברה ובנוסף ניתן לשלב עם טכניקות גנטיות‪.‬‬ ‫שיטות מולקולריות –‬ ‫אנליזה של תפקוד גנים – הזרקה של מקטעי דנ"א או רנ"א‬ ‫לתוך ביצית או עובר של דגי זברה‪.‬‬ ‫המיקטעים מחוברים לסמנים < זיהוי של ביטוי הגנים‪.‬‬ ‫ע"י ביטוי יתר או ביטוי מופחת של גנים ספציפיים ניתן‬ ‫ללמוד על תיפקודם‪.‬‬ ‫‪http://zfin.org/ZFIN‬‬ ‫‪21‬‬ ‫שיטות נפוצות במחקר בדגי זברה ‪ -‬המשך‬ ‫טוקסיקולוגיה –‬ ‫דגי זברה משמשים כסנטינלים לניטור וזיהוי רכיבים‬ ‫טוקסיים‪.‬‬ ‫מהווים חיית מודל לאנליזה של האפקטים הטוקסיים‪.‬‬ ‫שתי שיטות עיקריות‪:‬‬ ‫‪ – in-vivo‬א‪ .‬ביציות ועוברים‬ ‫ב‪ .‬דגים בוגרים‬ ‫‪ – in-vitro‬שורות תאים מדגי זברה‪.‬‬ ‫‪22‬‬ ‫שיטות נפוצות במחקר בדגי זברה ‪ -‬המשך‬ ‫הדמייה –‬ ‫פרמטר קבוע וחשוב בתפקוד תקין של תאים ‪ -‬שמירה על‬ ‫רמות סידן תאיות‪.‬‬ ‫יוני סידן משמשים כ‪ second messenger -‬אוניברסאלי‬ ‫בין תאים‪.‬‬ ‫‪ - aequorin‬חלבון הרגיש ליוני סידן ובנוכחותם יוצר אור‪.‬‬ ‫• משמש לסימון ובדיקה של התפתחות‪ ,‬התמיינות ומוות‬ ‫של תאים‪.‬‬ ‫• השימוש בו משולב במחקרי התפתחות עוברית‪,‬‬ ‫טוקסיקולוגיה וחקר פתולוגיות‪.‬‬ ‫• פיתוח דג טרנסגני‪.‬‬ ‫‪23‬‬ ‫דוגמאות למחקרים בדגי זברה‬ In vivo models of oncogene/tumor suppressor functions . Constitutive expression of oncogenic H-RAS leads to abnormal development. Study normal and tumor angiogenesis tg(fli1:GFP) transgenic embryo (16 somite stage) 24 ‫ המשך‬- ‫דוגמאות למחקרים בדגי זברה‬ The montage shows the zebrafish digital embryo (left halves, colors encode movement directions of cells) and the microscopy data (right halves) at different time points in zebrafish development. http://www.youtube.com/watch?v=JSMJ_47_5D4&feature=related 25 ‫ המשך‬- ‫דוגמאות למחקרים בדגי זברה‬ The zebrafish has emerged as an attractive vertebrate model for human diseases including Parkinson’s Disease (PD). In vivo drug discovery in the zebrafish Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species . 26 ‫ המשך‬- ‫דוגמאות למחקרים בדגי זברה‬ In Vivo Imaging of Embryonic Vascular Development Using Transgenic Zebrafish. Neurons: A fish-eye view of the brain. A microscope image showing nerve cells developing in the visual system of a zebrafish embryo. The nerve cells glow green because they express a gene for green fluorescent protein (GFP). This image was taken looking straight down on the zebrafish’s head 27 ‫ המשך‬- ‫דוגמאות למחקרים בדגי זברה‬ The Vascular Anatomy of the Developing Zebrafish: An Atlas of Embryonic and Early Larval Development. 28 ‫ המשך‬- ‫דוגמאות למחקרים בדגי זברה‬ The zebrafish embryo model in environmental risk assessment—applications beyond acute toxicity testing . The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. project Zebrafish as model for understanding the role of environmental chemicals in obesity, 2009 – 2014. A three-day-old zebrafish next to a human hair. 29 ‫מחקר בדגי זברה‬ http://www.youtube.com/watch?v=TlmagE9cIHg&feature=related 30 ‫גידול דגים במעבדה‬ ‫כמו בחיות מחקר אחרות‪ ,‬השמירה על בריאות הדגים‬ ‫חשובה ביותר‬ ‫שמירה על אוכלוסייה בריאה ומאוזנת ‪:‬‬ ‫שמירה על העקרונות האתיים – רווחת החיות‬ ‫מינימום איבוד חיות עקב מחלות ותמותה‬ ‫קיום מחקר תקין‬ ‫שמירה על סטנדרטיזציה‬ ‫ביטוי מקסימלי לפוטנציאל הפוריות של הדגים‬ ‫‪31‬‬ ‫בריאות דגים תלויה באיכות המים‪,‬‬ ‫תכנון ותפקוד של מערכת המים‪,‬‬ ‫תזונה נכונה‪.‬‬ ‫גידול דגים במעבדה‬ ‫התפרצות מחלה היא תוצאה של אינטראקציה בין‬ ‫המאכסן – הסביבה – הפתוגן‪.‬‬ ‫הפרדה בין פתוגן ראשוני למשני‪.‬‬ ‫‪32‬‬ ‫המים כסביבת חיים‬ ‫טמפרטורה‪:‬‬ ‫פרמטר קריטי להישרדות‪ ,‬התפתחות‪ ,‬גדילה‪ ,‬והתרבות של‬ ‫הדגים‪.‬‬ ‫יש להימנע משינויים חדים )לא יותר מ‪ 1.5 -‬מעלות ליום(‪.‬‬ ‫טמפ' אופטימלית להחזקה של דגי זברה – ‪ 24-28‬מעלות‪.‬‬ ‫חמצן מומס במים‪:‬‬ ‫שמירה על רמה קבועה‪.‬‬ ‫סימנים התנהגותיים לרמת חמצן לא תקינה‪.‬‬ ‫‪ CO2‬במים‪:‬‬ ‫טוקסיות ברמה גבוהה‬ ‫אפקט הרדמה עד המתה‬ ‫רעילות כרונית – אבנים בכליות‪.‬‬ ‫‪33‬‬ ‫המים כסביבת חיים ‪ -‬המשך‬ ‫סטורציה של גזים במים‬ ‫שמירה על לחץ הזרמת האויר למערכת‪.‬‬ ‫‪GBD = Gas Bubble Disease‬‬ ‫‪: pH‬‬ ‫דגי מים מתוקים מעדיפים ‪.pH = 7‬‬ ‫‪ pH‬מושפע ומשפיע גם על ‪ ,CO2‬מעגל החנקן‬ ‫‪34‬‬ ‫המים כסביבת חיים ‪ -‬המשך‬ ‫מוליכות‪:‬‬ ‫אינדיקטור למליחות שהיא פרמטר חשוב לגדילה ורבייה‪.‬‬ ‫הוספת מלחים על בסיס בדיקה בלבד‪.‬‬ ‫קשיות המים‪:‬‬ ‫כמות מלחי הקלציום והמגנזיום במים‪.‬‬ ‫חשוב להתייחס במערכות המבוססות על אוסמוזה הפוכה או‬ ‫מים מזוקקים‪.‬‬ ‫כלור‪:‬‬ ‫רמה גבוהה במים ממקורות רשותיים‪.‬‬ ‫כלורין מאד טוקסי לבע"ח ימיים‪.‬‬ ‫‪35‬‬ ‫המים כסביבת חיים ‪ -‬המשך‬ ‫מעגל החנקן‪:‬‬ ‫‪36‬‬ ‫בית החיות ומערכת המים‬ ‫שיקולים‪:‬‬ ‫חומרים עמידים למים ולחות‪.‬‬ ‫צנרת – עומס המים‪ .‬מערכות טיפול במים )בכניסה‬ ‫וביציאה(‪.‬‬ ‫תאורה – מחזור התאורה חשוב ביותר!‬ ‫‪ 12-16‬שעות אור‬ ‫סוג התאורה ועוצמה‬ ‫‪37‬‬ ‫מערכת מיזוג האויר – ‪ – HVAC‬אוורור‪ ,‬טמפ'‪ ,‬לחות‪.‬‬ ‫מערכת החשמל – בטיחות‪ ,‬חשמל חירום‪.‬‬ ‫מיכלי המים – שקופים‪ ,‬חזקים )משקל(‪.‬‬ ‫רעש וויברציות‪.‬‬ ‫מערכת המים‬ ‫רצוי שתהיה מודולרית –‬ ‫צרכים משתנים של חוקרים‬ ‫בידוד בין מערכות שונות‬ ‫בקרת בריאות‬ ‫תיקונים‬ ‫הגדרת המערכת‪ :‬סגורה‪ ,‬פתוחה‪ ,‬חצי‪-‬סגורה‪.‬‬ ‫החלפת מים במערכת‪ ,‬כ‪ 1-5% -‬מנפח המים‪.‬‬ ‫איזון המים לפני הזרמה למערכת‪.‬‬ ‫‪38‬‬ ‫מערכת המים ‪ -‬המשך‬ ‫‪ 3‬סוגי פילטרים‪:‬‬ ‫פילטר מכני – סינון חלקיקים מהמים‬ ‫דרגת ניקיון < > התנגדות לזרימת המים ומהירות סתימת‬ ‫הפילטר‪.‬‬ ‫פילטר כימי – ניקוי המים ממזהמים מולקולריים‬ ‫מספר שיטות‪ .‬הפילטר הנפוץ ביותר ‪ -‬פילטר פחם פעיל‪.‬‬ ‫פילטר ביולוגי – הפחתת רמת המזהמים שמקורם‬ ‫מהפרשות ע"י הפיכתם לצורות פחות טוקסיות‪.‬‬ ‫פילטר בעל שטח פנים גדול – לאיכלוס מושבות החיידקים‪.‬‬ ‫בניית ביו‪-‬פילטר מלא ומתפקד‪ 6 -‬שבועות‪.‬‬ ‫‪39‬‬ ‫מערכת המים ‪ -‬המשך‬ ‫מערכת בקרה‬ ‫מערכת מים אוטומטית ברובה‬ ‫משטר בקרה – בדיקות‪ ,‬טיפולים‬ ‫תיעוד‬ ‫בדיקת הדגים לפחות פעם‪-‬פעמיים ביום‪.‬‬ ‫התרעות על חריגה בפרמטרים קריטיים‪:‬‬ ‫טמפרטורת המים‪.‬‬ ‫רמת מים במיכלים‪.‬‬ ‫נפילת מתח‪.‬‬ ‫‪40‬‬ ‫תזונה‬ ‫סוג מזון – משתנה לפי גיל הדגים‬ ‫בוגרים וצעירים מעל גיל ‪ 10-14‬יום – מזון יבש‪ ,‬מסחרי‬ ‫הרכב ידוע )חלבונים‪ ,‬מינרלים‪ ,‬ויטמינים וכד'(‬ ‫איכסון נכון – למניעת הרס רכיבי מזון )למשל ויטמין ‪(C‬‬ ‫תאריך תפוגה‬ ‫דגיגים מבקיעה ועד גיל ‪ 10-14‬יום – מזון חי‬ ‫סרטנים )ארטמיה( שרק בקעו או פרוטוזואה )‪(paramecium‬‬ ‫גידול במעבדה‬ ‫דגים צעירים בגיל ‪ 10-21‬יום – מזון מעורב‬ ‫משטר האכלה‬ ‫‪41‬‬ ‫לא יותר מדי!‬ ‫‪1-3‬פעמים ביום‬ ‫כלל ‪ 5‬הדקות‬ ‫הכנסת דגים למערכת‬ ‫מקור הדגים –‬ ‫ספקים‬ ‫מוסדות מחקר אחרים‬ ‫איקלום‬ ‫קרנטינה –‬ ‫בידוד מוחלט‬ ‫שתי גישות‪:‬‬ ‫תקופת הסגר של ‪ 4-6‬שבועות‬ ‫רבייה בקרנטינה והעברת הביצים והעוברים בלבד ליחידה‬ ‫הראשית‪ ,‬לאחר חיטוי‪.‬‬ ‫‪42‬‬ ‫היבטים אתיים – ‪Fish Welfare‬‬ ‫מעקב קליני‬ ‫מעקב יומיומי אחרי מצב הדגים והתנהגותם‪.‬‬ ‫יש להכיר את המצב הנורמלי של הדגים ומתוך כך לאתר סימנים‬ ‫חריגים‪) .‬דוגמאות(‬ ‫העשרה‬ ‫אחזקה בקבוצות‪.‬‬ ‫העשרה שתאפשר מקלט‪/‬הסתתרות )צינורות פלסטיק(‪.‬‬ ‫סטרס וכאב‬ ‫‪43‬‬ ‫לדגים יש קולטנים לגירויים שונים)מכניים‪ ,‬אקוסטיים‪ ,‬כימיים‪,‬‬ ‫אור(‬ ‫מגוון דעות לגבי עוצמת תחושת הכאב ותחושת הסבל שדגים‬ ‫יכולים לחוש‪ .‬לאחרונה מכירים יותר ביכולת זו‪.‬‬ ‫הגישה במעבדה – לתת לחיות להנות מהספק‪.‬‬ ‫דוגמאות לסימנים קליניים חריגים‬ ‫שחיה לא תקינה‬ ‫חוסר שחיה )אלא אם מבהילים(‬ ‫דג שמופרד משאר הקבוצה‬ ‫התרכזות במקומות מסוימים במיכל‬ ‫קשיי נשימה‬ ‫התגרדות‬ ‫צבע עור שונה‬ ‫כיבים בעור ובזימים‬ ‫נקודות‪/‬גידולים‬ ‫נפיחות של הבטן‬ ‫עיניים בולטות‬ ‫‪44‬‬ ‫היבטים אתיים – ‪Fish Welfare‬‬ ‫מעקב קליני‬ ‫מעקב יומיומי אחרי מצב הדגים והתנהגותם‪.‬‬ ‫יש להכיר את המצב הנורמלי של הדגים ומתוך כך לאתר סימנים‬ ‫חריגים‪.‬‬ ‫העשרה‬ ‫אחזקה בקבוצות בגודל אופטימלי )ת‪.‬ל‪ .‬לאגרסיביות(‪.‬‬ ‫העשרה שתאפשר מקלט‪/‬הסתתרות )צינורות פלסטיק(‪.‬‬ ‫סבל‪ :‬אי‪-‬נוחות‪ ,‬סטרס וכאב‬ ‫‪45‬‬ ‫לדגים יש קולטנים לגירויים שונים)מכניים‪ ,‬אקוסטיים‪ ,‬כימיים‪,‬‬ ‫אור(‬ ‫מגוון דעות לגבי עוצמת תחושת הכאב ותחושת הסבל שדגים‬ ‫יכולים לחוש‪ .‬לאחרונה מכירים יותר ביכולת זו‪.‬‬ ‫הגישה במעבדה – לתת לחיות להנות מהספק‪.‬‬ ‫היבטים אתיים ‪ -‬המשך‬ ‫הרדמה‬ ‫יש להרדים דגים לפני כל פרוצדורה שנחשבת כגורמת כאב או‬ ‫סטרס רב‪.‬‬ ‫רצוי לשמור על צום של הדג ‪ 12-24‬שעות לפני ההרדמה‪.‬‬ ‫ניתן להעריך את שלבי ההרדמה השונים בדגים ע"י אופן‬ ‫השחיה‪ ,‬תגובתיות‪ ,‬שמירה על שיווי משקל‪ ,‬קצב נשימה וכד'‪.‬‬ ‫יש לדאוג לאוורור תמיסת ההרדמה בגלל נטיה לירידה בחימצון‬ ‫בסיום הפרוצדורה‪ ,‬יש להשגיח על הדג באופן רציף עד‬ ‫שמתאושש ורפלקס ההתיישרות )‪ (righting reflex‬שלו חוזר‪.‬‬ ‫חומרי הרדמה‬ ‫)‪Tricaine Methane Sulfonate (MS-222‬‬ ‫‪Benzocaine‬‬ ‫‪ CO2‬מומס במים – פחות מומלץ‪.‬‬ ‫‪46‬‬ ‫ המשך‬- ‫היבטים אתיים‬ :‫שלבי ההרדמה בדגים‬ Stage Plane Response I Swimming erratically with some loss of equilibrium. Opercular activity increased. II Obvious loss of equilibrium. Efforts to maintain an upright position with slow and aimless swimming. Opercular activity decreased. III 1 2 3 IV Loss of muscle tone. Opercular activity increased. Swimming movements absent. Opercular activity rapid and shallow. No response to external stimulation. Surgical plane of anesthesia. Opercular movements very shallow. The fish may be easily revived by moving it through untreated water. Spasmodic over distension of the opercula. Cardiac failure ensues within a few minutes. Revival is possible up to the point of cardiac failure. 47 ‫תפיסה‬ ‫טכניקות עבודה עם דגים‬ ‫רשת – יש לשמור על מזעור סטרס‪.‬‬ ‫ריסון – בעדינות‪ .‬ידיים רטובות או בד עדין רטוב‪.‬‬ ‫סימון‬ ‫בדר"כ ברמת המיכל‪.‬‬ ‫סימון פרטני – בדגים גדולים ‪ -‬חתך בסנפיר‪ ,‬תגיות‪ ,‬מיקרוצ'יפ‪.‬‬ ‫ג'נוטייפינג‬ ‫‪ - Fin clip‬הפקת דנ"א ובדיקת ‪.PCR‬‬ ‫דימום‬ ‫בדגים גדולים‪ .‬מהוריד הקאודלי או מהלב‪.‬‬ ‫מקובל לקחת עד ‪ 1‬מל' לכל ‪ 1‬קג' דג‪ ,‬בדימום לא טרמינלי‪.‬‬ ‫הזרקות‬ ‫‪48‬‬ ‫הזרקות נפוצות – ‪ IP‬או ‪IM‬‬ ‫אתרי דימום והזרקות‬ ‫דימום‬ ‫הזרקה ‪IM‬‬ ‫הזרקה ‪IP‬‬ ‫‪49‬‬ ‫היבטים אתיים ‪ -‬המשך‬ ‫המתה‬ ‫השיטה הרצויה היא חשיפה של הדג למינון יתר של חומר‬ ‫הרדמה )‪ (MS-222‬ואז וידוא המתה ע"י וידוא הפסקת נשימה‬ ‫לאורך זמן או ע"י דקפיטציה או אקסנגואינציה‪.‬‬ ‫במידת האפשר יש לבצע את ההמתה בשני שלבים הדרגתיים –‬ ‫הרדמה בתמיסת הרדמה ואז העברה לתמיסה מרוכזת יותר‬ ‫להמתה‪.‬‬ ‫אם יש חשש להשפעת חומר ההרדמה על נושא הבדיקה‬ ‫במחקר‪ ,‬כדאי לבצע ניסוי פרלימינרי שיבדוק את הנושא לפני‬ ‫ביצוע הניסוי עצמו‪.‬‬ ‫‪– American veterinary Medical Association –AVMA‬‬ ‫הנחיות להמתת דגים )כמו חיות אחרות(‪.‬‬ ‫‪50‬‬ ‫תוכנית בקרת בריאות‬ ‫תוכנית מעקב לניטור קבוע של המערכת והדגים‬ ‫החזקת מיכל של דגים סנטינלים ובדיקות שלהם‬ ‫בדיקות מים מהמערכת‬ ‫ברגע שרואים סימנים חריגים יש לבדוק ולטפל‪:‬‬ ‫רישום כל הסימפטומים וההיסטוריה של האוכלוסייה ומערכת המים‬ ‫בדיקת ‪ PM‬של דגים ובדיקת דגימת מים‬ ‫בניית רשימת אבחנות מבדלות‬ ‫שלילת אבחנות מהרשימה‬ ‫דיאגנוזה‬ ‫טיפול‬ ‫נקיטת דרכי מניעה להישנות מקרים דומים בעתיד‬ ‫‪51‬‬ 52 ‫מחלות‬ ‫‪Mycobacteriosis‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬כרוני – איבוד תאבון‪ ,‬אמסיאציה‪,‬איבוד פיגמנטציה‪,‬‬ ‫ירידה בפוריות‪ .‬אקוטי – אקסופתלמיה‪ ,fin rot ,‬כיבים ופטכיות על‬ ‫העור‪ ,‬בטן נפוחה )‪.(dropsy syndrome‬‬ ‫פתולוגיה‪ :‬גרנולומות קטנות בכבד‪ ,‬טחול‪ ,‬כליה ואברי הרבייה‪.‬‬ ‫היסטולוגיה‪ :‬גרנולומות‪ ,‬נוכחות חיידקים מאורכים‪.acid fast ,‬‬ ‫אבחנה‪ :‬כל הנ"ל ‪ +‬בידוד החיידק בתרבית )איטי מאד(‪.PCR .‬‬ ‫טיפול‪ :‬סילוק האוכלוסיה הנגועה‪ ,‬סילוק הביו‪-‬פילטר‪ ,‬חיטוי מערכת‬ ‫המים ע"י כלור )הזרמה למשך ‪ 3‬ימים(‪ ,‬ואז ייבוש ושטיפות‪ .‬הכנת‬ ‫המערכת ואיזונה ואיכלוסה מחדש‪.‬‬ ‫אחרי מספר חודשים< יש לבצע בדיקות של הדגים‪.‬‬ ‫זואונוזה‪ :‬אינפקציה עורית – ‪.fish handler’s granuloma‬‬ ‫‪ .Self limiting‬סכנה לאינפקציה סיסטמית באנשים עם כשל חיסוני‪.‬‬ ‫‪53‬‬ Emaciation Dropsy syndrome 54 ‫מחלות‬ ‫‪Bacterial Septicemia‬‬ ‫פתוגנים ראשוניים )כמו ‪ Streptococcus iniae‬או ‪Edwardsiella‬‬ ‫‪ (tarda‬או משניים‪ ,‬אופורטוניסטים ) ‪Aeromonas, Flexibacter,‬‬ ‫‪.(Flavobacterium‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬ספסיס – אקסופתלמוס‪ ,‬מאמץ נשימתי‪ ,‬נפיחות של‬ ‫הבטן‪ ,‬פטכיות וכיבים על פני הגוף‪.‬‬ ‫פתולוגיה‪ :‬גודש ודימומים באיברים פנימיים‪ ,‬כבד חיוור‪ ,‬נוזל דמי בחלל‬ ‫הבטן‪.‬‬ ‫אבחנה‪ :‬סימנים קליניים ‪ +‬בידוד חיידקים בתרבית‪.‬‬ ‫טיפול‪ :‬אנטיביוטיקה מתאימה ) ‪Sulfadiazine-Trimethoprin,‬‬ ‫‪ (enrofloxacin, Oxytetracycline‬המומסת במים ונדגים מוטבלים‬ ‫בה לפרק זמן מסוים‪.‬‬ ‫‪55‬‬ ‫מחלות‬ ‫‪White spot disease‬‬ ‫הפתוגן‪.ciliated protozoa .Ichthyophthirius multifiliis :‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬נקודות לבנות קטנות )כ‪ 1 -‬ממ'( על העור‪ ,‬הסנפירים‬ ‫והזימים‪) .‬כאילו פיזרו על הדג גרגירי מלח או סוכר(‪ .‬הדגים‬ ‫ישתפשפו בקירות המיכל או ברצפה‪ ,‬ואם יש פגיעה בזימים ניתן‬ ‫לראות נשימה מאומצת‪.‬‬ ‫אבחנה‪ :‬הסתכלות מיקרוסקופית במשטח מהעור‪ .‬נראים טפילים עם‬ ‫גרעין בצורה דמויית פרסה )מאפיין(‪.‬‬ ‫טיפול‪ :‬מספר אפשרויות‪ :‬העלאת טמפ' המים באופן הדרגתי על מנת‬ ‫לזרז את מחזור החיים של הטפיל‪ ,‬במקביל לאימרסיה בתמיסת‬ ‫מלח‪ .‬טבילות חוזרות בפורמלין מדולל‪ .‬טיפול ב‪Malachite green -‬‬ ‫אינו מקובל בדגי מעבדה‪ ,‬בעיקר במחקרים גנטיים‪ ,‬בגלל‬ ‫הפוטנציאל הטרטוגני והמוטגני שלו‪.‬‬ ‫‪56‬‬ White spot disease Ichthyophthirius multifiliis 57 ‫מחלות‬ ‫‪Aquatic Mycosis‬‬ ‫הפתוגן‪.Saprolegnia spp. :‬‬ ‫פטריה מצויה במים בעיקר אם יש בהם פסולת אורגנית ולפעמים גם‬ ‫על הביו‪-‬פילטר‪ .‬פתוגן אופורטוניסטי שיכול לגרום לאינפקציה‬ ‫במקרים של עור פצוע‪ ,‬טראומה או תנאי אחזקה לקויים‪.‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬הפטריה תופיע כשכבה פילמנטית לבנה‪/‬חומה‪/‬אפורה‪,‬‬ ‫עם מעין חוטים צמריים על העור או הסנפירים‪ .‬בתנאים מתאימים‬ ‫ובנגיעות גבוהה יכולה להתפשט במהירות‪ ,‬לגרום אינפקציה משנית‬ ‫של חיידקים שיגרמו לספסיס ואף לגרום למוות של הדג‪.‬‬ ‫אבחנה‪ :‬הסתכלות מיקרוסקופית במשטח מהעור של הדג‪.‬‬ ‫טיפול‪ :‬בנגיעות קשה ‪ -‬המתה‪ .‬ניתן לטפל במי מלח אך זה בעיקר‬ ‫פרופילקטי‪ .‬טיפול מוצלח יותר הוא ב‪ Malachite green -‬אבל‬ ‫כאמור בעייתי בדגי מעבדה‪.‬‬ ‫‪58‬‬ Fish fungus, Saprolegnia sp. 59 ‫מחלות‬ ‫)‪Velvet Disease (Gold Dust Disease‬‬ ‫מחלה נפוצה בדגים ממשפחת ‪.Danio‬‬ ‫הפתוגן‪Parasitic dinoflagellates of the genus Piscinoodinium :‬‬ ‫הטפיל שולח פילמנטים דמויי שורשים לתוך האפיתליום בעור‪ ,‬בסנפירים‬ ‫ובזימים‪.‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬על הדג ניתן לראות מעין אבקה מוזהבת‪ ,‬הדג ישתפשף‬ ‫בקירות וברצפה בגלל הגירוי העורי‪ .‬ירידה בפוריות‪ ,‬לטרגיה‪ .‬אם‬ ‫הזימים מעורבים נראה נשימה מאומצת והאופרקולום יהיה פתוח‪.‬‬ ‫אבחנה‪ :‬הסתכלות מיקרוסקופית על משטח מהשכבה הרירית של העור‬ ‫או על מקטע מהסנפיר הנגוע‪.‬‬ ‫טיפול‪ :‬טבילות בתמיסת מלח במקביל להעלאה הדרגתית של הטמפ'‬ ‫כדי לזרז את מעגל החיים של הטפיל‪ .‬כמו כן ניתן לטפל בפורמלין‬ ‫מדולל או ב‪ ,quinine hydrochloride -‬או ב‪.Malachite green -‬‬ ‫‪60‬‬ ‫מחלות‬ ‫אינפקציה של העור ע"י פרוטוזואות שונות‬ ‫הפתוגנים‪ :‬מגוון פרוטוזואות כגון‪ Trichodina, Chilodonella, :‬ועוד‪.‬‬ ‫מתיישבים על העור והזימים‪ .‬קשר לאיכות ירודה של המים‪.‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬גירוי של העור המתבטא בגרד – הדג ישתפשף בדפנות‬ ‫המיכל‪ ,‬ארוזיות על העור‪ ,‬הפרשה מוגברת של ריר‪ ,‬מאמץ נשימתי‪.‬‬ ‫בנגיעות גבוהה ניתן לראות מצב כללי ירוד‪ ,‬ירידה בפוריות‪ ,‬מצוקה‬ ‫נשימתית ומוות‪.‬‬ ‫אבחנה‪ :‬הסתכלות מיקרוסקופית על משטח גרוד מהעור או מקטע‬ ‫מהזימים‪.‬‬ ‫טיפול‪ :‬יכלול תיקון הטיפול במערכת המים לשיפור איכות המים‪ ,‬טבילות‬ ‫במי מלח או פורמלין מהול‪.‬‬ ‫‪61‬‬ chilodonella Trichodina 62 ‫מחלות‬ ‫‪Intestinal Nematodes‬‬ ‫הפתוגנים‪ :‬מינים שונים של נמטודות וצסטודות‪.‬‬ ‫פתוגן הנפוץ בדגי זברה‪.Pseudocapillaria tormentosa :‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬בדר"כ אין‪ .‬בנגיעות קשה ייראו סימנים כלליים כמו‬ ‫עיכוב גדילה‪ ,‬פגיעה בפוריות ואמסיאציה‪.‬‬ ‫אבחנה‪ :‬בדיקה מיקרוסקופית של צואה טריה לנוכחות ביצים‪ ,‬או זיהוי‬ ‫התולעים הבוגרות בתוכן מעי בנתיחה של דג‪.‬‬ ‫טיפול‪ :‬טבילות במים בהם מומס ‪ Trichlorfonmebendazole‬או‬ ‫‪ .fenbendazole‬ניתן להשתמש גם ב‪ ivermectin -‬במיני דגים‬ ‫מסויימים‪.‬‬ ‫‪63‬‬ ‫מחלות‬ ‫)‪Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV‬‬ ‫בעל חשיבות גדולה במשפחת הסלמונידים‪) .‬בזברה‪ ,‬ממצא אקראי(‬ ‫הפתוגן‪. Double-stranded RNA Birnavirus :‬‬ ‫סימנים קליניים‪ :‬בדר"כ סוב‪-‬קליני‪ .‬בצעירים יתכן מופע אקוטי שיגרום‬ ‫למוות‪ .‬דגים בוגרים בתנאי סטרס יכולים להראות סימנים כלליים של‬ ‫אקסופתלמיה‪ ,‬נפיחות של הבטן‪ ,‬צואה רירית‪ ,‬אנמיה‪.‬‬ ‫פתולוגיה‪ :‬כבד וטחול חיוורים‪ ,‬מערכת העיכול מלאה בנוזל רירי‪ .‬פטכיות‬ ‫בפילורוס ובלבלב‪.‬‬ ‫היסטולוגיה‪ :‬נקרוזיס של תאים אצינריים בלבלב ובחלקים מהמעי‪,‬‬ ‫שינויים דגנרטיביים בכבד ובכליה‪.‬‬ ‫אבחנה‪ :‬סימנים קליניים וזיהוי הוירוס בשיטות סרולוגיות‪.‬‬ ‫טיפול‪ :‬אין טיפול יעיל‪ .‬חיסול האוכלוסייה הנגועה‪ ,‬חיטוי המערכת‬ ‫והתחלה מחדש‪.‬‬ ‫‪64‬‬ ‫מחלות לא זיהומיות‬ ‫תזונה לא מתאימה )סוג‪ ,‬כמות(‬ ‫דפורמציות מקריות באיברים שונים‬ ‫דלקת לא זיהומית – )בזימים‪ ,‬בעור בלב(‬ ‫חומרים מגרים‬ ‫סטרס‬ ‫מקומות הזרקה‬ ‫שינויים ברמות שונות ולכן מומלצת בדיקה קפדנית של דגים לפני‬ ‫תחילת ניסוי ובסיומו‪.‬‬ ‫‪65‬‬ ‫תודה‬ ‫‪66‬‬ ‫להקת דגי ‪ GloFish‬באקווריום‬