Maj and Tor Nessling Foundation IN SITU BIOREMEDIAATION MAHDOLLISUUDET Martin Romantschuk Helsingin yliopisto Ympäristötieteiden laitos Lahti KEINOT SELVITTÄÄ NÄYTTEEN MIKROBISTON KOOSTUMUS • SUORA VISUALISOINTI (MIKROSKOPOINTI) KOHTEEN KOKO MIKROBISTO MIKROBIEN KASVATUS DIVERSITEETIN MÄÄRITYS DNA:n ja RNA:n KAUTTA (DGGE, sekv.) RASVAHAPPOKOOSTUMUKSEN ANALYSOINTI HAJOTUS TOIMINNAN ANALYSOINTI (Biolog, entsyymit) MALLINTAMINEN SIIRROSTAMINEN Luonnon omat mikrobit usein riittävät • Suomessa saastuneita maa-alueita yli 20 000 • Luontainen hajoaminen: Orgaaniset saasteet hajoavat, mutta usein liian hitaasti • Bakteerien ja muiden mikrobien hajotusvoimaa voi stimuloida optimoimalla olosuhteita • Mikrobeja voi myös lisätä, mutta useimmiten vertaus “tuotanto ei nouse lisäämällä työntekijöitä vaan parantamalla niiden työskentelyedellytyksiä” pätee • Paikan päällä puhdistus yleistyy vähitellen. Vakioratkaisu: massan vaihto - vastaanottoasemat täyttyvät - uusia lupia ei saa  Vaihtoehto massanvaihdolle: PIMA in situ puhdistus eli maahan viedään hajotusvoimaa Joskus ainoa vaihtoehto TUTKIMUKSESTA KENTTÄSOVELLUKSIIN • LABORATORIO – Mikrokosmeja (1 - 20 L) ja altaita 500 L; Rumpu 5 m3 – Mallinnus, yhdistelmien testaus • PILOTTILAITOS – Lysimetrikenttä (16 x 2 m3 sylintereitä) – Mallinnus kenttäoloissa Lahdessa • KONTTIMITTAKAAVA – Yritysyhteistyö, mm. Terrasor Oy • KENTTÄ – Puhdistettavia kohteita: Mikkeli, Jalasjärvi ja Kontula – Yritysyhteistyö, mm. Nordic Envicon Oy Käsitteitä • PIMA pilaantunut maa (saastunut maakohde) • Bioremediaatio – PIMA:n puhdistus yl. mikrobien avulla – Fytoremediaatio – kasviavusteinen puhdistus – Ritsomemediaaito – juuristopuhdistus • • • • • • Biostimulaatio – kohteen mikrobien olojen parannus Bioaugmentaatio – mikrobeja lisätään kohteeseen Luontainen puhdistuminen (natural attenuation, MNA) In situ – kohteessa (maan alla tms) Ex situ – muualla On site – kohteen luona TÄYDEN MITTAKAAVAN ÖLJYISEN MAAN ON SITE PUHDISTUS: BAKTEERIEN JA RAVINTEIDEN LEVITYS TIIVISEEN MAAHAN ELEKTROKINETIIKAN AVULLA 600 m3 tiivistä öljyllä saastunutta maata Käsittely kohteen luona Marraskuu – maaliskuu (jopa 20 oC) Auman sisällä +35 oC ¾ aumasta puhdistui Loput puhdistui erillisessä käsittelyssä VAIHTOEHTO: saasteiden hajotus maan sisällä: in situ bioremediaatio Photo: Tuula Tuhkanen Avain onnistumiseen: Kohteen ominaisuuksien tuntemus • Riittävästi näytteitä: – saasteen pitoisuus, laatu ja levinneisyys – Muut saasteet (kuin ennestään tunnetut) – C:N:P eli ravinteet – pH – Maan laatu: läpäisevyys, tasalaatuisuus ym. – Muut seikat Biologisen puhdistukset tehostamiskeinot: pullonkaulojen poisto • Lämpötilan nosto • Hapen lisäys – Hapellinen vesi, happea vapauttavat yhdisteet • Muiden elektroniakseptorien lisäys – liukenevuus veteen suuri (NO3, Fe3+ SO4) – tarvittavan veden määrä pienempi • Ravinteiden lisäys (N, P, …) – Urea, metyleeniurea, salpietari, fosfaatti, … • Surfaktanttien lisäys  biosaatavuus paranee – Syklodekstriini, Tween, … In situ käsittelyn ulottaminen koko pilaantuneelle aluelle Haasteet/ratkaisumallit • Epätasaistesti jakautunut saaste – Nesteen kierrätys kaikkialle (sähkökinetiikka) – Kohdistettu kierrätys/kohdistettu käsittely hot spotteihin – (menetelmä?) • Maaperän rakenne epätasainen – Yhdistelmäkäsittely jolla nesteen kierrätys taataan kaikkialle (imeytys + sähkökinetiikka) Biologisen in situ kunnostuksen riskit ja niiden hallinta • Epätietoisuus biohajoavuudesta/hajoamistuotteista Mallinnus & testaus • Biohajotus vaikea ulottaa kaikkialle Maalajit ja saasteen jakautuma selvitettävä  Käsittely valittava testitulosten perusteella • Pilaavat yhdisteet mobilisoituvat käsittelyn tuloksena Riittävää seurantaa Milloin siirretään maata, milloin puhdistetaan paikan päällä? Maaperä on saastunut Saaste vähenee itsestään Monitorointi: saaste ei leviä luontainen puhdistum. Saaste ei vähene itsestään Mallinnus: biohajotus toimii Mikrobien lisäys tai biostimulaatio Mallinnus: kemiallinen hapetus toimii Kemiallinen hapetus  Päätös tapauskohtaisesti testien kautta! Hajotus ei toimi mallinnuksessa Massan vaihto Mykoritsa (Suillus bovinus + bakteerit) kolonisoi öljyistä TAUSTAA Uusi tutkimus perustuu aikaisempiin havaintoihin: – PAH hajotus aktivoituu humusmaassa – Humus indusoi nopeaa adaptaatiota – Juuristo ei lisää humuksen tehoa – Mikrobeja voi liikuttaa elektrokineettisesti Cumulative evolution of 14CO2 from pyrene degradation Equal pyrene degradation in both cases Monoaromaattihajotusbakteerin hajotukvyn leviäminen: TOL-plasmidi leviää konjugaation kautta m-toluaattipitoisessa maassa LIMES-projekti: PIMA:n MIKROBIEKOLOGIAA HUMUSEFEKTIN TESTAUS KENTTÄOLOSUHTEISSA Sähköosmoosi liikuttaa nesteitä maassa Elektro-migraatio: ionit liikkuvat varauksen mukaan Elektro-osmoosi: vesi liikkuu katodia kohti tiiviissä maassa - + - + + - - + - ANODI - - + - - + + - KATODI Tiiviissä maassa: Tasavirta saa veden liikkumaan kohti katodia Lisätty vesi kuljettaa ravinteita ja bakteereja Lämpötila nousee Maata voi kuivattaa • Kosteusgradientti muodostuu • pH-gradientti muodostuu •Bakteerisolut liikkuvat veden mukana mutta myös vastavirtaan moisture content (%) Microkosmitestit 50 - 17 cm 40 9 cm 30 1cm 20 10 0 -12 3 9 -1 (log (cfu g )) 5 bacterial density in soil (log (cfu g-1 )) bacterial density in soil -4 0 4 8 12 Fine sand (without electricity) 0 days 1 day 2 days 3 days 6 days 7 days 7 -8 distance from centreline (cm) Fine sand (with electricity) 9 + 0 days 1 day 2 days 3 days 6 days 7 days 7 5 3 -12 -8 -4 0 4 8 distance from centreline (cm) 12 -12 -8 -4 0 4 8 distance from centreline (cm) 12 Kohde 1: BIOAUGMENTAATIO vs. BIOSTIMULAATIO ILMASTUS/RAVINNELISÄ/MIKROBILISÄYS mg/kg dw maaperän öljypitoisuus 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Alku 1 2 3 pitoisus alussa ja päivinä 28 ja 61 1.Kontrolli (vain puulastuja) 2. Ravinteita 3. A. calcoaceticus 4. Rikastusviljelmä 4 maaperän öljypitoisuus 3000 Aloitus Urealisäys Ravinteita + lastuja Kontrolli 2 Kontrolli (ei lastuja) Ravinne 2 Ravinteita (ei lastuja) Mikrobilisäys Mikrobeja (ei lastuja) Aloitus mg/kg dw 2500 2000 1500 1000 500 0 Alku 5 6 7 8 pitoisuus alussa ja päivänä 61 Mikrobipitoisuus Maa huokoiseksi puulastuilla Kontrolli Kontrolli Ravinne Ravinteita Bioaugmentaatiolla Bakteeri A. calcoaceticus ei näkyvää Rikastus Rikastusviljelmä vaikutusta mikrobi- 10 000 000 1 000 000 100 000 0 9 23 päivä 36 diversiteettiin 61 Mikrobipitoisuus 100 000 000 cfu/ml cfu/ml 100 000 000 Urealisäys + lastuja Ravinne Kontrolli 2 Kontrolli (ei lastuja) Ravinne 2 Ravinteita (ei lastuja) Mikrobilisäys Ravint+bakt (ei last) 10 000 000 1 000 000 100 000 1 15 29 päivä 42 61 Kohde 2: VANHA POLTTOAINEASEMA • Bensa-asema 80-luvulle  maaperässä öljytuotteita > 10000 mg/kg • n.1000 m3 pilaantunutta • In situ käsittely jotta rakennukset säilytettäisiin • Soili ohjelma  mahdollisuus testata kokeellisia menetelmiä Puhdistustilanne Maan pinta Vuotanut öljysäiliö Lämmön, hapen, ravinteiden, yms. syöttö valuttamalla tai “sähköpumppauksella” Maapartikkeleita joissa öljykalvo Pohjaveden pinta Kosteaa maata bakteereita öljylammikko Liuennutta öljyä Pohjaveden virtaus Bensa-asema (jatk.) • Käsittelyjärjestys (labrasta kentälle) – Huokosilman imu  ei vaikutusta; liian märkä – Biostimulaatio: ravinteita, elektroniakseptoreita ja lämpöä elektro-kinetiikalla Diesel poistui, bensa ei – Electro-osmoottinen maan kuivaus  uudestaan huokosilman imu  onnistui Laboratoriomittakaavan varusteita Bensa-asema II + anodi - + kontti - katodi I III B C muuntaja + Pumppu perustus + - A + 1m D Bensan pitoisuuden muutos haihduttamisen kautta Vesipitoisuus verrattuna maan veden pidätyskykyyn 2000 1800 C5-C10 mg/kg dw 1600 water content 59 %, control evaporation prevented 1400 1200 water content 59 % 1000 800 water content 75 % 600 water content 88 % 400 200 water content 100 % 0 0 3 9 weeks Bensan haihtuminen nopeaa elektro-osmoosilla kuivatetusta maasta: -Testattu laboratoriossa eri kostestasoilla - Käytetty kentällä 2000 1800 1600 C5-C10 mg/kg ka Bensa haihtuu nopeasti electro-osmoosilla kuivatusta maasta: -Testattu eri kosteustasoilla laboratoriossa -Käytetty kentällä Bensaa jäljellä maassa kolmen viikon haihduttamisen jälkeen 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Ei veden lisäystä, Ei veden lisäystä, korkki kiinni korkki auki Vesi 40% Vesi 70% Vesi 100% Bensa-asema käsittelyn jälkeen Kohde 3: Dieselillä pilantuneen maan bioremediaation laboratoriomallinnus: Surfaktanttien käyttö CYCLODEXTRIN vs. MÄNTYSUOPA •Anna Haukka, Katri Lepikkö, Virpi Pajunen, Milla Punkari 1 % CD 1 % PS nutrients + PS nutrients + CD nutrients Contol (water) LAB MALLINNUS: Cyclodextrin (CD) vs. mäntysuopa (PS) - öljyinen maa 3.5 l (ca. 5 kg) - Ravinteita: kalium nitraatti C:N 1:10 fosfaattipuskuri (5-10 mM K2HPO4 ja 5-10 mM NaH2PO4) - Nesteiden kierrätys: 1-2 x viikossa +16 °C LAB MALLINNUS: Cyclodextrin (CD) vs. Mäntysuopa (PS) pH mikrobiaktiviteetti LAB MALLINNUS: Cyclodextrin (CD) vs. Mäntysuopa (PS) Dieselöljyä maassa PÄÄTELMÄT: Mäntysuopa + ravinteet stimuloi mikrobiaktiviteettia Mäntysuopa ei lisännyt dieselin hajottamista CD ja ravinteet lisäsivät dieselin hajotuksesta CD lisäsi vaikutusta verratuna pelkkiin ravinteisiin  TULOKSIA OSIN KÄYTETTY KENTÄLLÄ Kohde 4: kreosoottilla saastunut ratapölkkykyllästämö • Käytössä 80-luvun loppupuolelle • Kreosoottia maassa ja pohjavedessä peruskallioon asti (15 m maan alla) • Laboratoriotestit  pilottesti in situ  toimi • Ei in situ jatkoa vaan maan poisto • Täyden mittakaavan bioremediaatio off site myöhemmin Pilottesti: ca 100 m3 ravinteikas happirikas vesi kierrätettiin elektro-osmoosin ja imeytyksen avulla Pilotmittakaavan in situ käsittely kreosootin poistamiseksi Contaminate d soil Ano de quartz sand air pump Aeration of the recycled liquid 1000 800 mg/kg d.w. 600 400 200 0 3 4 5 6 7 8 9 Weeks Marsh 3 m Marsh 4 m Building 1-3 m Building 4.5 m 40 30 20 Outside Cathode 10 -10 Weeks 11 9 10 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 Temperature (ºC) • Laboratoriotesti rohkaiseva • Pilotmittakaava kohteessa • 100 m3 käsitelty kierrättämällä vettä (O2, pH puskuroitu, N, P lisäykset) • lpt: 6 oC  20 – 50 oC • PAH pitoisuus aleni n. 90 % neljässä kuukaudessa Recycling of aerated liquid Catho de Addition of nutrient and microbial solution Mikkelin ratapölkkykyllästämö PILE 4 15 m3 HUMUS Soil moved to waste treatment station PILE 3 60 m3 DETERGENT P + NUTRIENTS F O R E S T PILE 2 60 m3 CD + NUTRIENTS CONTAINER HUMUS and NUTRIENTS PILE 4 Humus or leca-gravel as a 10 cm layer + Methyleurea 1H 3H 5L 7L 2H 4L 6L 8H SURFACTANT + NUTRIENTS PILES 1-3 PILE 1 Ca. 170 m3 WATER + NUTRIENTS NUTRIENTS PILES 1-3 • CaO2 450 kg • Methyleneurea 126 kg • Potassium nitrate 80 kg (1 g/kg) (0,28 g/kg) (0,17 g/kg) Circulation of liquids PILE 1 WATER PILE 2 1% Cyclodextrin PILE 3 5% Detergent-P emulsifier Kreosootin ex situ käsittely: -Biostimulaatio -Biostimulatio plus cyclodextriini -Humus effect Täyden mittakaavan kreosoottibioremediaatio Kreosootilla saastuneet maa-aumat 8.11.2013 44 PÄÄTELMÄ TUNTEMALLA MIKROBIT, OLOSUHTEET, HAJOTETTAVAT YHDISTEET JA NÄIDEN SUHTAUTUMINEN TOISIINSA BIOHAJOTUSTA VOIDAAN TEHOSTAA - MYÖS IN SITU