Next generation sequencing
Kjersti Haugum, 19. mars 2015
1
Oversikt
Introduksjon
Teknologi – ulike plattformer
Anvendelse
2
Sangersekvensering
3
Human Genome
Project 1990-2003
• International Human Genome
Sequencing Consortium
• Celera Genomics
4
Shotgun-sekvensering
5
Human Genome Project – innflytelse
Biologisk kunnskap
6
Human Genome Project – innflytelse kostnader
7
8
NGS platforms – common features:
• Random fragmentation of starting DNA, ligation with custom
linkers = “a library”
• Library amplification on a solid surface (bead or glass)
• Direct step-by-step detection of each nucleotide base
incorporated during the sequencing reaction
• Hundreds of thousands to hundreds of millions of reactions
imaged per instrument run = “massively parallel sequencing”
• Shorter read lengths than capillary sequencers
• A “digital” read type that enables direct quantitative comparisons
• A sequencing mechanism that samples both ends of every
fragment sequenced (“paired end” reads)
Elaine Mardis: NHGRI Current Topics in Genome Analysis 2012
9
http://454.com/products/technology.asp
10
11
454
Pyrosekvensering
Sequencing by synthesis
Library generation
12
Cluster generation
13
Sequencing by synthesis
http://www.illumina.com/Documents/products/Illumina_Sequencing_Introduction.pdf
14
15
Sequencing by ligation
16
Semiconductor sequencing
17
Single molecule sequencing
• Trenger ikke amplifisering på forhånd.
• Signal leses av i real-time.
Teknologi:
Pacific Biosciences
18
Oxford Nanopore
Pacific Biosciences
Pacific video
19
Oxford Nanopore
Nanopore video
Credit: John MacNeill
20
21
NGS i mikrobiologi
• Mikrobioell evolusjon
• Genomisk bakteriell epidemiologi
• Sekvensbasert profiling og metagenomics
av komplekse mikrobielle samfunn
• (De novo) sekvensering ved utbrudd
• Genekspresjon
• Protein-DNA interaksjoner
• Framtiden: kulturuavhengige tilnærminger
for patogen deteksjon
22
Paper 3
23
95 non-O157 STEC til NGS
HUS n=19
Epidemiolgisk link n=4
Diverse n=72
24
HUS-assosiert
n=23
Sekvensering med Illumina HiSeq
Paired End
95
Matepair
48
Resultat: 21-447
contigs
25
●: LEE positive
STEC
Red letters: HUSassociated STEC
HUS-group
2
26
HUS-group 1
Random forests analysis
27
Classified as
HUS
Classified as
non-HUS
Total
HUS-strains
18
5
23
non-HUSstrains
2
29
31
Sammenligning av geninnhold
Accessory genome
• Ingen unike gener
Core genome
• Ingen unike gener
28
Sammendrag
Genetisk og fylogenetisk heterogene
Riktig klassifisering av mange isolat
Ingen spesifikke gener eller genvarianter
tilstede kun i HUS-assosierte STEC
29
RNA-sekvensering STEC
15 HUS
30 STEC
30
15 nonHUS
HUS
(n=15)
Indusert
Ikkeindusert
31
NonHUS
(n=15)
Indusert
Ikkeindusert
DNA-sekvensering av S. agalactiae
GBS-stamme 1
GBS-stamme 2
32
Sekvensering av humant bocavirus 1
«Luftveisinfeksjoner
hos barn»
PCR
33
200
Sekvensering av diverse bakterieisolat
STEC
GBS
S. condimenti
34
Illumina, PacBio
Illumina
Illumina
Utprøving av MinION fra
MAP: MinION Access
Program
35
Diagnostisk metagenomikk i fæces
ønsker å undersøke hvilket potensiale
metagenomikk-analyse har for deteksjon av
enteropatogene agens fra fæcesprøver uten
bruk av kultur i primærdiagnostikken ved AMM
Metagenomikk
36
• Sekvensering av alle nukleinsyrer isolert
direkte fra et prøvemateriale uten
amplifisering eller anrikning på forhånd
37