High throughput sequencing 19032015
Next generation sequencing Kjersti Haugum, 19. mars 2015 1 Oversikt Introduksjon Teknologi – ulike plattformer Anvendelse 2 Sangersekvensering 3 Human Genome Project 1990-2003 • International Human Genome Sequencing Consortium • Celera Genomics 4 Shotgun-sekvensering 5 Human Genome Project – innflytelse Biologisk kunnskap 6 Human Genome Project – innflytelse kostnader 7 8 NGS platforms – common features: • Random fragmentation of starting DNA, ligation with custom linkers = “a library” • Library amplification on a solid surface (bead or glass) • Direct step-by-step detection of each nucleotide base incorporated during the sequencing reaction • Hundreds of thousands to hundreds of millions of reactions imaged per instrument run = “massively parallel sequencing” • Shorter read lengths than capillary sequencers • A “digital” read type that enables direct quantitative comparisons • A sequencing mechanism that samples both ends of every fragment sequenced (“paired end” reads) Elaine Mardis: NHGRI Current Topics in Genome Analysis 2012 9 http://454.com/products/technology.asp 10 11 454 Pyrosekvensering Sequencing by synthesis Library generation 12 Cluster generation 13 Sequencing by synthesis http://www.illumina.com/Documents/products/Illumina_Sequencing_Introduction.pdf 14 15 Sequencing by ligation 16 Semiconductor sequencing 17 Single molecule sequencing • Trenger ikke amplifisering på forhånd. • Signal leses av i real-time. Teknologi: Pacific Biosciences 18 Oxford Nanopore Pacific Biosciences Pacific video 19 Oxford Nanopore Nanopore video Credit: John MacNeill 20 21 NGS i mikrobiologi • Mikrobioell evolusjon • Genomisk bakteriell epidemiologi • Sekvensbasert profiling og metagenomics av komplekse mikrobielle samfunn • (De novo) sekvensering ved utbrudd • Genekspresjon • Protein-DNA interaksjoner • Framtiden: kulturuavhengige tilnærminger for patogen deteksjon 22 Paper 3 23 95 non-O157 STEC til NGS HUS n=19 Epidemiolgisk link n=4 Diverse n=72 24 HUS-assosiert n=23 Sekvensering med Illumina HiSeq Paired End 95 Matepair 48 Resultat: 21-447 contigs 25 ●: LEE positive STEC Red letters: HUSassociated STEC HUS-group 2 26 HUS-group 1 Random forests analysis 27 Classified as HUS Classified as non-HUS Total HUS-strains 18 5 23 non-HUSstrains 2 29 31 Sammenligning av geninnhold Accessory genome • Ingen unike gener Core genome • Ingen unike gener 28 Sammendrag Genetisk og fylogenetisk heterogene Riktig klassifisering av mange isolat Ingen spesifikke gener eller genvarianter tilstede kun i HUS-assosierte STEC 29 RNA-sekvensering STEC 15 HUS 30 STEC 30 15 nonHUS HUS (n=15) Indusert Ikkeindusert 31 NonHUS (n=15) Indusert Ikkeindusert DNA-sekvensering av S. agalactiae GBS-stamme 1 GBS-stamme 2 32 Sekvensering av humant bocavirus 1 «Luftveisinfeksjoner hos barn» PCR 33 200 Sekvensering av diverse bakterieisolat STEC GBS S. condimenti 34 Illumina, PacBio Illumina Illumina Utprøving av MinION fra MAP: MinION Access Program 35 Diagnostisk metagenomikk i fæces ønsker å undersøke hvilket potensiale metagenomikk-analyse har for deteksjon av enteropatogene agens fra fæcesprøver uten bruk av kultur i primærdiagnostikken ved AMM Metagenomikk 36 • Sekvensering av alle nukleinsyrer isolert direkte fra et prøvemateriale uten amplifisering eller anrikning på forhånd 37
© Copyright 2024