דני שטיינברג / 2014
12בנובמבר1122 , הצעת מחקר המוגשת לשולחו האבוקדו פיתוח ממשק להתמודדות עם מחלת הבוטריוספריה במטעי אבוקדו מבוגרים על ידי דני שטיינברג ,סטנלי פרימן ועומר פרנקל ,המחלקה לפתולוגיה של צמחים ,מינהל המחקר החקלאי ,בית דגן ערן רווה ,המחלקה לעצי פרי ,תחנת מחקר גילת אלי סימנסקי ,חברת נבטים ,מושב כרמל יונתן מעוז ,גרנות תקציר .1 בשנים האחרונות זוהו במטעי אבוקדו בוגרים תסמינים של התייבשות ענפים המתחילה בשוליים והמתקדמת לכיוון מרכז העץ .העלים והפירות היבשים נשארים מחוברים לענפים וכאשר ההתייבשות מגיעה לענפי שלד יש פגיע ה משמעותית ביבול .מהרקמות הצמחיות הסימפטומטיות בודדו ברוב המקרים פטריות המשתייכות למין .Botryiosphaeriaהזיהוי אומת בשיטות מולקולאריות .לאחרונה הוגשה לקרן המיזמים של המדען הראשי של משרד החקלאות תוכנית מחקר מקיפה שנקראת מיזם חוס"ן הבוטריוספריה .המחקרים שיתבצעו במסגרת מיזם חוס"ן בוטריוספריה יתמקדו בפיתוח גישות שיאפשרו לייצר חומר ריבוי (שתילים) בריא ובהתמודדות עם גורם המחלה בנטיעות צעירות (= נטיעות עד גיל שנתיים) .הצעת המחקר הנוכחית ,המוגשת לשולחן האבוקדו ,משלימה את מיזם חוס"ן בוטריוספריה והיא תתמקד במטעים המבוגרים .היעד של תוכנית המחקר הנוכחית הוא לפתח ממשק גידול שיאפשר להתמודד עם מחלת הבוטריוספריה במטעים מבוגרים .המטרות הספציפיות של המחקר הנוכחי הן.2 : חקר האפידמיולוגיה של גורם המחלה וכימות הגורמים המשפיעים על התפתחותו; .1בחינה (ברמת הצמח השלם) של יחסי הגומלין המתקיימים בין הפתוגן לפונדקאי ו .2 -פיתוח ממשק גידול שיאפשר להתמודד עם המחלה ביעילות במטעים מבוגרים .שאלות המחקר בהן נעסוק בנושאים הקשורים למטרה 2הן :מהם מקורות המידבק הראשוני במטעים המבוגרים? מתי מתרחשת ההפצה המשנית של גורם המחלה ומה מנגנון ההפצה העיקרי של גורם המחלה במרחב?ו מה משפיע על החמרת התסמינים בעצים נגועים? שאלות המחקר בהן נעסוק בנושאים הקשורים למטרה 1הן :באילו רקמות צמחיות הפתוגן מתפתח? מה מנגנון ההשפעה הפיזיולוגית של המחלה על הצמחים? מה קורה בענפים הפגועים? מדוע נגרמת התייבשות ותמותה של ענפים? והאם יש שונות בתגובה של כנות וזנים לפתוגנים מחוללי המחלה? שאלות המחקר בהן נעסוק בנושאים הקשורים למטרה 2הן :מתי ואיך לבצע סניטציה של רקמות סימפטומטיות ומה עושים עם הגזם? האם ניתן למנוע את ההחמרה בעוצמת הנזק אותו גורמת המחלה בעצים נגועים? איך אפשר להגן על העצים ולמנוע את ההתרחשות של הדבקות חדשות? במהלך המחקר אנחנו מתכוונים לבצע מעקבים ,תצפיות וניסויים במטעים מסחריים הנגועים בדרגות נגיעות שונות באזורי גידול בכל אזורי הארץ ממח"ע בדרום ועד לעמק זבולון בצפון .המטעים אולחו בהדבקה טבעית ,התפתחה בהם מחלה בעוצמה שונה והם מגודלים ומטופלים בשיטות הגידול המקובלות .במינהל המחקר החקלאי נבצע ניסויים בשתילים בני שנתיים הגדלים בשקיות ובמיכלים; שתילים אלה יאולחו בגורם המחלה באופן מלאכותי והם יגודלו בחממות ובתאי צמיחה בהם שוררים תנאים מבוקרים .בנוסף ,נבצע ניסויים ובדיקות במעבדה .בחלק זה של המחקר נשתמש בשיטות מולקולאריות למניפולציה של הפטריות מחוללות המחלה ולחקר המבנה הגנטי של האוכלוסייה. מבוא ותיאור הבעיה .2 בשנים האחרונות זוהו במטעי אבוקדו בוגרים תסמינים של התייבשות ענפים המתחילה בשוליים והמתקדמת לכיוון מרכז העץ .העלים והפירות היבשים נשארים מחוברים לענפים וכאשר ההתייבשות מגיעה לענפי שלד יש פגיעה משמעותית ביבול .תסמינים אלה מתאימים לאלה המכונים באנגלית die backובעברית – תמותה לאחור. במספר אזורים בארץ תופעות אלה היו חדשות אך בחלק מהמקומות התסמינים נצפו גם בעבר .במקרה זה ,נראה 1 שחלה החמרה משמעותית בעוצמתן ובשכיחותן של התופעות .כשענפים הפגועים נחתכו באזור הגבול שבין הרקמה הבריאה לפגועה התברר ש מערכת העיצה פגועה ונקרוטית .מהרקמות הצמחיות הסימפטומטיות בודדו ברוב המקרים פטריות המשתייכות למין .Botryiosphaeriaהזיהוי אומת בשיטות מולקולאריות .בוטריוספריה הוא השם של השלב המיני של פטריות השונות זו מזו בשלב האל-מיני שלהן .על פי הספרות המקצועית ,פטריות מקבוצת הבוטריוספריה תוקפות צמחים מעוצים וגורמות לתסמינים הדומים לאלה שתוארו למעלה. בשנתיים האחרונות ביצענו מאות רבות של בידודים מרקמות צמחיות סימפטומטיות שנדגמו ממטעים של עצי פרי שונים ,מכרמי גפן יין ומאכל ומעצי יער שונים .בחלק ניכר מהבידודים התפתחו פטריות שונות המשתייכות למין בוטריוספריה וכ – 211תבדידים זוהו בשיטות מולקולאריות .הפטריות העיקריות שבודדו מאבוקדו היו ) Lasiodiplodia pseudotheobromae (LPTו .L. theobromae (LT) -פטריות אלה בודדו גם מעצי אבוקדו נגועים מקליפורניה ,צ'ילה ,ומקומות נוספים .התבדידים אומתו למין בעזרת ריצוף אזור הInternal ( ITS - )transcribed spaces regionשל ה DNA -הריבוזובאלי המשמש לזיהוי מדויק של מין זה בהשוואה לרצפים שהופקדו במאגרי מידע .לאחר שבודדנו את הפטריות מהרקמות הסימפטומטיות ניסינו להשלים את מבחן קוך והתברר שהפטריות שבודדו מרקמות אבוקדו סימפטומטיות אכן פתוגניות כלפי עצי אבוקדו (הן גרמו לתסמינים דומים לאלה שנצפו במטעים) ובנוסף גם גרמו לתסמינים בשקד ,מנגו ,גפן יין ,לימון גס ,איקליפטוס ,ברוש ואלת המסטיק .גם בספרות דווח שפטריות אלה הן רב-פונדקאיות ובכל המקרים מצאנו טווח הפונדקאים שמצאנו מתאים לדיווחים מהספרות. הדיווחים בספרות המקצועית הקשורים למחלות הנגרמות על ידי פטריות הבוטריוספריה באבוקדו מתרכזים, רובם ככולם ,בתיאור התסמינים והפטריות המעורבות .מעטים הפרסומים בהם דווח ממצאי מחקרים העוסקים בביולוגיה של גורם המחלה ,ביחסי הגומלין המתקיימים בין גורם המחלה לצמח הפונדקאי ,בהשפעה של גורמי סביבה על התפרצות המחלה ,בדרכים שמאפשרים למנוע את התפתחות המחלה או בממשק הגידול אותו יש ליישם במטעים בהם תסמיני המחלה כבר נראו בחומרה כזו או אחרת .הנחת המוצא העיקרית במחקרים שפורסמו היא שמקור המידבק הוא מקומי (בעצים הגדלים במטע) ,שנבגי גורם המחלה מופצים מענפים נגועים לסביבתם הקרובה במהלך אירועי גשם וחודרים לרקמות הצמחיות דרך פצעים הנגרמים במהלך הגיזום .לכן מאמצי ההדברה מוכוונים לסניטציה של איברים צמחיים סימפטומטיים ולהגנה על פצעי הגיזום באמצעות תכשירי הדברה .בכל מקרה ,לא כל הנחות מוצא אלה הוכחו בפועל ואף אחת מהן לא נבחנה ואומתה בישראל. בהסתמך על תצפיות וניסויים ראשוניים שבצענו העלנו את ההיפותזה שמקור המידבק העיקרי של המחלה בנטיעות חדשות הוא משתילים שנשתלו כשהם היו נגועים בגורם המחלה; מקור המידבק במשתלות הוא מחומר ריבוי נגוע המיוצר מעצי אם מאולחים .היפותזת עבודה זו הייתה הבסיס לתוכנית מחקר מקיפה שנקראת מיזם חוס"ן בוטריוספריה ,שהוגשה לאחרונה לקרן המיזמים של המדען הראשי של משרד החקלאות .מיזם חוס"ן בוטריוספריה מתמקד רובו ככולו בפיתוח גישות שיאפשרו לייצר חומר ריבוי (שתילים) בריא ובהתמודדות עם גורם המחלה בנטיעות צעירות (= נטיעות עד גיל שנתיים) .אין כוונה לעסוק במסגרת המיזם בפיתוח גישות להתמודד עם גורם המחלה במטעים מבוגרים (= מטעים שגילם שלוש שנים ויותר) .הצעת המחקר הנוכחית ,המוגשת לשולחן האבוקדו ,משלימה את מיזם חוס"ן בוטריוספריה והיא תתמקד במטעים המבוגרים. היעד ,היפותזת העבודה ומטרות המחקר .3 היעד של תוכנית המחקר הנוכחית הוא לפתח ממשק גידול שיאפשר להתמודד עם מחלת הבוטריוספריה במטעים מבוגרים .לצורך כך אנו מגדירים ארבעה מצבים אפשריים: במטעים בהם קיימת נגיעות גבוהה (בכל העצים זוהו תסמיני המחלה האופייניים בחומרה הגורמת פגיעה משמעותית לצימוח ונזק כלכלי ליבול) היעד המרכזי הוא להפחית את הנגיעות לרמה שבה לא יגרם נזק כלכלי ואם ניתן לרמה של נגיעות נמוכה; במטעים בהם קיימת נגיעות ברמה בינונית (במרבית מהעצים זוהו תסמיני המחלה האופייניים אך נראה שלא נגרם עדיין נזק כלכלי משמעותי) היעד המרכזי הוא להפחית את חומרת המחלה לרמה של נגיעות נמוכה ואם ניתן ,להכחיד את גורם המחלה ולרפא את העצים; במטעים בהם תסמיני המחלה נראו ברמה נמוכה (בעצים בודדים זוהו תסמיני המחלה בענף זה או אחר) היעד המרכזי הוא להכחיד את גורם המחלה ולרפא את העצים; במטעים בהם תסמיני המחלה לא נראו עדיין (מטעים בריאים) היעד המרכזי הוא להגן על העצים ולמנוע את ההופעה של גורם המחלה. 2 במחקר זה אנו מתכוונים להתמקד בארבעת המצבים בסדר עדיפות עולה :להקדיש את מירב המאמצים להתמודד עם המצב המסוכן ביותר (מטעים בנגיעות גבוהה) ואת מיעוטן להתמודדות עם המצבים הפחות מסוכנים פחות (מטעים בריאים) .כמובן שאמצעים שיתאימו להתמודדות עם מצבי מחלה מסוימים יתאימו גם להתמודדות עם מצבי מחלה אחרים .ההיפותזה העומדת בבסיס המחקר הנוכחי היא שפיתוח גישות ממשק להתמודדות עם גורם המחלה מחייב הבנה טובה של המערכת הביולוגית הכוללת ובכלל זה של השפעות תנאי הסביבה על גורם המחלה ושל קשרי הגומלין המתקיימים בין הפתוגן לפונדקאי .המטרות הספציפיות של המחקר הנוכחי הן: .2חקר האפידמיולוגיה של גורם המחלה וכימות הגורמים המשפיעים על התפתחותו; .1בחינה (ברמת הצמח השלם) של יחסי הגומלין המתקיימים בין הפתוגן לפונדקאי; .2 פיתוח ממשק גידול שיאפשר להתמודד עם המחלה ביעילות בארבעת מצבי הנגיעות שהוגדרו למעלה. .4 עיקרי תוכנית העבודה 1.4 חקר האפידמיולוגיה של גורם המחלה וכימות הגורמים המשפיעים על התפתחותו 1.2.2מהם מקורות המידבק הראשוני במטעים המבוגרים? [חלק זה יתבצע בשנות המחקר הראשונה והשנייה באחריות עומר פרנקל ובהשתתפות דני שטיינברג ,אלי סימנסקי ויונתן מעוז] התסמינים האופייניים של מחלת הבוטריוספריה נראו לראשונה לפני כשנתיים במטע מח"ע ולאחר מכן במטעים שונים בכל רחבי הארץ .במרבית המטעים לא נראו תסמינים דומים אף פעם בעבר ונשאלת השאלה מה מקור המידבק ומהיכן היגיע הפטרייה הפתוגנית .לשאלה זו חשיבות רבה מפני שהיא תנאי לפיתוח גישות למניעת הפצת המחלה לאזורים ולמטעים בהם עדיין היא לא הגיע .כדי לנסות ולענות על שאלה זו נשתמש בשיטות מרחבות לאיפיון דגם הפיזור המרחבי של המחלה במטעים נגועים ובשיטות מולקולאריות לאיפיון הזהות הגנוטיפות של תבדידי הפתוגן שהתפתחו במטעים מסחריים נגועים. דגם הפיזור המרחבי של הנגיעות במטעי אבוקדו מבוגרים ובכרמים החדשים .התסמינים המתפתחים בעצי אבוקדו מבוגרים (התנוונות ,התייבשות ותמותה של ענפים) ברורים וניתן לזהותם בקלות .בחמישה מטעים, לפחות ,בהם יזוהו התסמינים בפעם הראשונה יוגדר שטח נתון שגודלו יהיה 01עצים לאורך 21שורות ,לפחות; כל אחד מהעצים יבחן ויזואלית ונגיעתו תרשם .הנתונים ישמשו להכנת מפה מרחבית של הנגיעות .דגם הפיזור המרחבי של העצים הסימפטומטיים יקבע באמצעות שיטות סטטיסטיות מתאימות ,כמו Morisita index of ) .dispersion (Iδאם מקור המידבק הראשוני הוא מחוץ לחלקה עצמה – ממטעים או עצי יער הגדלים בסמוך, ניתן להניח שדגם הפיזור יהיה מדורג (גרדיאנט) כאשר חומרת המחלה בסמוך למקור המידבק תהיה הגבוהה ביותר וככל שיגדל המרחק מהמקור כך תקטן חומרת המחלה; אם מקור המידבק הראשוני הוא מקומי ניתן להניח שדגם הפיזור יהיה אקראי; אם דגם הפיזור יהיה במוקדים ננסה לאתר את הסיבה לכך (למשל ,הבדלים במועד הנטיעה ,הזן או הכנה או הפצה משנית מקומית) .חלק זה של המחקר יתבצע בשנה הראשונה והשנייה של המיזם. בשנת המחקר השנייה נשתמש בסמנים מולקולאריים שיפותחו במסגרת מיזם חוס"ן בוטריוספריה כדי לנסות ולהגדיר את מקור המידבק של הפטרייה שהתפתחה במטעים .מהמטעים שימופו במהלך השנה הראשונה נדגום ונבודד תבדידים של הפתוגנים מחוללי המחלה .מכל התבדידים יופק DNAונשתמש בסט הסמנים ל – genotypingשל כל אוכלוסיה .הנתונים ישמשו לחישוב המגוון הגנטי ,השונות הגנטית של כל אוכלוסיה ואללים פרטיים .נשתמש בתוכנה Structureלזיהוי מבנה האוכלוסייה בעזרת סטטיסטיקה ביאסיינית ובתוכנה GenAlexלמדדי השונות הגנטית ולחישוב מבנה האוכלוסייה .נחשב את זרימת הגנים בין ובתוך מטעים בעזרת תוכנות כגון .Bayesass 1.2.1מתי מתרחשת ההפצה המשנית של גורם המחלה ומה מנגנון ההפצה העיקרי של גורם המחלה במרחב? [חלק זה יתבצע בשנות המחקר הראשונה והשנייה באחריות דני שטיינברג ובהשתתפות אלי סימנסקי ויונתן מעוז] הנחות המוצא שלנו הן שגופי הריבוי האופייניים של הפטריות גורמות המחלה הם נבגים אל-מינים (פיקנידיוספורות) ושנבגים אלה המופצים במרחב למרחקים קצרים על ידי טיפות מי גשם במהלך ההתרחשות של אירועי גשם .למידע אודות מועד ההפצה של אברי הריבוי ומרחק ההפצה חשיבות רבה לקביעת המועדים בהם כדאי להגן על רקמות צמחיות בריאות בפני הדבקה באמצעות ריסוס בתכשירי הדברה (אם ימצאו תכשירים יעילים) .כדי לבחון את התקפות של הנחות המוצא שלנו נבצע בשנת המיזם הראשונה ניסויים שיכללו שני טיפולים ,כלהלן .הטיפול הראשון יהיה טיפול היקש (ובו לא יוסרו הענפים הנגועים) והטיפול השני יהיה טיפול בו נבצע סניטציה קפדנית ,מתמשכת ,בה נסיר את כל הרקמות הצמחיות הסימפטומטיות .אורך כל חלקת ניסוי יהיה 3 8עצים ורוחבה – חמש שורות .מעבר לשני עצי הטיפול (הנמצאים במרכז החלקה) כל 28העצים האחרים בכל חזרה יעברו סניטציה קפדנית .במועדים שונים במשך השנה נדגום משני עצי הטיפול (הנמצאים במרכז החלקה) ומהעצים המקיפים אותם ענפים עשבוניים .הענפים הנדגמים יילקחו למעבדה וננסה לבודד מהם את גורמי המחלה .כך נוכל לקבוע מתי מתרחשת ההפצה של נבגי המחלה מעצים סימפטומטיים לעצים בריאים הנמצאים בסביבתם ואת מרחק ההפצה .בכל ניסוי נציב קורא נתונים אלקטרוני ( )data loggerהמודד ברציפות את הטמפרטורה ואת הלחות היחסית .נתונם אלה ,יחד עם מידע אודות מועדי ירידת גשמים ועוצמתם יאפשרו לנו להגדיר את המועדים בהם קיימת הפצה משמעותית של נבגי הפטריות המעורבות. 1.2.2מה משפיע על החמרת התסמינים בעצים נגועים? [חלק זה יתבצע בשנות המחקר הראשונה והשנייה באחריות דני שטיינברג ובהשתתפות אלי סימנסקי ויונתן מעוז] בתצפיות שבצענו במחקר המקדים במטעים מסחריים התקבל הרושם שבמהלך השנה היו מועדים בהם התרחשו שינויים משמעותיים בחומרת התסמינים בעצים הנגועים והיו מועדים בהם נראה היה לכאורה שהמחלה "נעצרה". חשוב להגדיר מה הגורמים להתפתחות הלא-רציפה של התסמינים כדי שניתן יהיה לפתח גישות מיטביות לבקרת המחלה .הגורמים העשויים להשפיע על קצב התקדמות המחלה בעצים נגועים עשויים להיות קשורים לתנאי הסביבה (כמו הטמפרטורה) ו/או לגורמים הקשורים לשלבי ההתפתחות הפיזיולוגיים של העצים (כמו גלי צימוח, גדילת פירות ,וכו') .כדי לבחון את השפעת תנאי הסביבה נבצע ניסויים בתנאים מבוקרים; כדי לאמוד את השפעת שלבי ההתפתחות הפיזיולוגיים נבצע מעקבים מפורטים במטעים מסחריים. השפעת הטמפרטורה על התפתחות המחלה תבחן בניסויים בתנאים מבוקרים .שתילים בני שנתיים מהזן האס יאולחו בהדבקה מלאכותית במקום מוגדר על גבי הגזע .שתילים לא מאולחים ישמשו כהיקש .לאחר שיראו תסמיני המחלה האופייניים ,יחולקו השתילים המאולחים לשלוש קבוצות ויוצבו בחדרי גידול מבוקרי טמפרטורה. הטמפרטורות יהיו 12 ,11ו – 21מעלות צלזיוס (בהקבלה לטמפרטורות המרביות בחורף ,סתיו/אביב וקיץ) .מאחר וכל השתילים יהיו באותו שלב התפתחות פיזיולוגי ניתן יהיה בניסויים אלה להגדיר את ההשפעה הבלעדית של הטמפרטורה על התפתחות המחלה .לאחר שהשתילים יונחו בחדרי הגידול השונים יערך מעקב אחר התפתחות המחלה ותקבע ההשפעה של הטמפרטורה על התפרצותה. ההשפעה המשולבת של שלבי הגידול הפיזיולוגי ותנאי הסביבה (טמפרטורה ותנאי סביבה האחרים) על התפרצות המחלה בעצים נגועים תקבע במעקבים שנבצע במטעים מסחריים נגועים .מידי חודש עד חודשיים נבצע מעקב אחר חומרת התסמינים המתפתחים ואחר הופעה של תסמיני מחלה חדשים בעצים נגועים שיסומנו .במטעים נציב קוראי נתונים אלקטרוניים (דאטא-לוגרים) שיאספו נתונים של טמפרטורה ולחות .בכל מועד הערכה נרשום את השלב הפיזיולוגי של העצים .המעקבים יתבצעו בחמישה מטעים לפחות ,ממח"ע בדרום ועד עמק זבולון בצפון. בכל מטע יסומנו 11עצים של הזן העיקרי ועוד 21-11עצים של הזן המפרה .כך נקבל גם מידע באם קיימים הבדלים בהתפרצות המחלה בין זנים שונים. 1.4 בחינה (ברמת הצמח השלם) של יחסי הגומלין המתקיימים בין הפתוגן לפונדקאי 1.1.2 באילו רקמות צמחיות הפתוגן מתפתח? [חלק זה של המחקר יתבצע בשנות המחקר הראשונה והשנייה באחריות סטנלי פרימן] בספרות המקצועית דווח שפטריות מקבוצת הבוטריוספריה חודרות לרקמות צמחיות דרך פצעים .בתצפיות שבצענו באבוקדו נראה שהפתוגנים חודרים לענפים הרב-שנתיים במקום החיבור של ענפים אלה עם הענפונים החד-שנתיים .נראה שהחדירה היא במקומות אלה מפני ששם יש סדקים/פצעים .לאחר ההדבקה הפטרייה מתפשטת לאורך הרקמות הפנימיות של הענפים הרב שנתיים .באזורים הנגועים הרקמה הפנימית משנה את צבעה מהצבע הבהיר האופייני של רקמה בריאה לצבע חום נקרוטי .הרקמה הפגועה ,הנקרוטית ,היא רקמת הקסילם אך במספר מקרים נראה שגם אזור הקליפה ,הפלואם ,נפגע .שינוי צבע לא מרמז בהכרח על המקום בו נמצאת בפועל הפטרייה מפני שיתכן שהתפטיר נמצא הרבה מעבר למקום בו נראים תסמיני הנקרוזה .לחילופין יתכן שהנקרוזות מתפתחות במקומות מרוחקים ממקום הימצאות התפטיר .חשוב לדעת היכן נמצאת הפטרייה בפועל כי מידע זה חיוני לביצוע פעולות סניטציה .בנוסף ,מידע זה ירמז על המנגנון בו פוגעת הפטרייה ברקמות הצמחיות (ראה סעיף 1.1.1להלן) מיקום הפטרייה ברקמות הנגועות יבחן בעזרת שימוש בפטרייה מהונדסת גנטית ל( GFP -חלבון פלואורסצנטי זוהר) .פלסמיד המכיל את החלבון יוחדר לפטרייה באחד השיטות המקובלות (אלקטרופורציה לנבגים נובטים, שיטת הפרוטופלאסטים או בעזרת אגרובקטריום-טרנספקציה) המבוצעות במעבדה של פרימן באופן רוטיני. נשתמש בפטרייה הזוהרת שתתקבל לאילוח רקמות מעוצות של שתילים .לאחר מכן יילקחו רקמות צמחיות 4 מהשתילים הנגועים ,במרחקים שונים ממקום האילוח ,ממקומות סימפטומטיים וממקומות א-סימפטומטיים. דגימות אלה יבחנו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי (בו ניתן לראות את תפטיר הפטרייה הצבוע בצבע זוהר) וכך נוכל לקבוע היכן נמצא תפטיר הפטרייה בפועל. מיקום תפטיר הפטרייה יקבע גם בשיטות בידוד קלסיות תוך שימוש בשתילים שיאולחו באופן מלאכותי ובדגימות שיאספו ממטעים מסח ריים שם התרחשה הדבקה טבעית .נאלח שתילים צעירים בפטריות הפתוגניות במקומות מוגדרים .לאחר שיראו תסמיני המחלה האופייניים ננסה לבודד את גורם המחלה מרקמות הנמצאות במרחקים שונים ממקום האילוח ונרשום אם במקום הבידוד נראו או לא נראו תסמינים ויזואליים של המחלה .הבידודים יתבצעו בנפרד מהקסילם ומהפלואם .בידודים דומים יבוצעו מענפים חד ורב-שנתיים שידגמו מעצים מבוגרים הגדלים במטעים מסחריים ,בהם התרחשה הדבקה טבעית. 1.1.1מה מנגנון ההשפעה הפיזיולוגית של המחלה על הצמחים? מה קורה בענפים הפגועים? מדוע נגרמת התייבשות ותמותה של ענפים? [חלק זה של המחקר יתבצע בשנות המחקר השנייה והשלישית באחריות ערן רווה ובהשתתפות סטנלי פרימן] תהליך התייבשות בשטח נעשה בשלבים .בתחילה הנזק נראה כנזק המלחה ,ורק קצות העלים מתייבשים .בהמשך חלה התייבשות של כלל טרף העלים ביחד עם הענף עליו הם יושבים .לא ברור האם תהליך תמותת הרקמות קשור בהימצאות העץ בתנאי עקה הכולל חוסר איזון ברמות המינראלים (מחסורים או צבירה עודפת לרמה של רעילות), האם הדבר קשור בסתימה פיזית של מערכת ההובלה (כתוצאה מפרוק דופן התאים של צינורות הקסילם או סתימה פיזית של מערכת ההובלה) ,נוכחותו של רעלן כזה או אחר ,או שילוב בין הגורמים השונים .במהלך העבודה נבחן את הקשר שבין רמת נגיעות הענף לבין מאזן המינראלים שבעלים (ובעץ) ,מידת השפעת נוכחות הפטרייה על כושר תנועת המים אל העלים דרך מערכת הקסילם ,והשפעת הנגיעות על הרכב המינראלים הנע במערכת הקסילם. על מנת לבחון שאלות אלו נבצע אנליזה של הרכב המינראלים ויסודות ההזנה השונים בעלים ובנוזל הקסילם. הדוגמאות עליהן נעבוד יאספו מענפים/עצים עם רמות שונות של נגיעות .בדיקת העלים תעשה על פי המקובל בספרות (יבוש ,טחינה ,ועיכול בחומצה או על בסיס מיצוי מימי של החומר הטחון .הפקת נוזל הקסילם תעשה בעזרת צנטרפוגה על פי טכנולוגיה אותה פיתחנו להדרים (שיטה בה אנו שולטים על הלחץ המופעל על עמודת המים שבענף כך שביכולתנו למצות בנפרד את המים הנעים במערכת ההובלה ואת אלו שמקורם בתאים החיים של רקמת הקסילם) .נושא השפעת הנגיעות בפטרייה על כושר הובלת המים במערכת הקסילם תעשה הן על בסיס מדידות פורומטריה ,והן על בסיס הזרקה ישירה של צבע למערכת הקסילם תוך מעקב אחר יכולת תנועת הצבע לאורך הענף והן על בסיס עבודה היסטולוגית. בחלק מהניסויים בהם אילחנו שתילי אבוקדו באופן מלאכותי תמותת השתילים הייתה מהירה מאד ( 1-7ימים). ממצאים אלה העלו את החשד שהפטרייה מפרישה טוקסינים והם אלה שגורמים לתגובה הסימפטומטית המהירה .לצורך בחינת הנושא ננקוט בשתי שיטות .בשיטה הראשונה נגדל את הפטרייה במצע נוזלי ,נאסוף את התסנין (ללא תפטיר או נבגים של הפטרייה) .בשיטה השנייה נשתמש בנוזל הקסילם שיופק מענפים נגועים בדרכים שפורטו בפ סקה הקודמת .התסנין או נוזל הקסילם ישמשו לאילוח ענפים ושתילים (עם וללא פציעה) .כביקורת חיובית נבצע אילוח עם תפטיר של הפטרייה וכביקורת שלילית אילוח בו נשתמש במצע נקי (ללא תפטיר) או תסנין ובנוזל קסילם שיופק מצמח בריא .לאחר האילוחים נעקוב אחר הופעת תסמינים אופייניים לאורך זמן. .1.1.2האם יש שונות בתגובה של כנות וזנים לפתוגנים מחוללי המחלה? [חלק זה של המחקר יתבצע בשנת המחקר השלישית באחריות סטנלי פרימן] מתצפיות מסחריות התקבל הרושם שהזן האס הוא הרגיש ביותר למחלה מפני שזן זה נטוע במרבית המטעים בהם התפתחו תסמינים בחומרה גבוהה .ממצאים של בדיקות מקדימות שבצענו לפני התחלת המחקר מצביעות על כך שהזן האס אינו בהכרח הזן הרגיש ביותר .בנוסף נראה שיש זנים שמגלים עמידות יחסית (לא חסינות) לגורמי המחלה .כדי לאפיין את התגובה של זנים וכנות שונות לגורמי המחלה נשתמש בשלוש שיטות :אילוח קטעי ענפים מנותקים ,אילוח שתילים בתנאים מבוקרים ומעקב אחר התפתחות המחלה בחלקות מסחריות .במחקרים המקדימים שבצענו פיתחנו שיטה לאילוח רקמה צמחית (קטעי ענפים) מנותקת .נשתמש בשיטה זו לבחינה ראשונית של תגובת כנות וזנים לפתוגנים גורמי המחלה .על פי השיטה מניחים קטעי ענפים באורך של כ – 0סמ' בעוביים שונים ע"ג אגר (המשמש מקור ללחות) בתוך צלחות פטרי .לאחר מכן יוצרים במרכז הקטע פצע קטן ועליו מניחים טיפה עם תרחיף נבגים או דסקית אגר עם תפטיר הפטרייה .הצלחות מוצבות להדגרה בתאי גידול בטמפרטורה של 11מעלות צלזיוס באור .בהמשך מעריכים את מדת ההתפשטות של הנגע ממקור ההדבקה על גבי קטעי הענפים המנותקים ואורך הנגע מהווה מדד לתגובת החומר הצמחי (רגישות/עמידות) לפתוגן בו השתמשנו. כהשוואה יאולחו קטעי ענפים במים מעוקרים או בדסקית סטרילית של אגר .כהשוואה ,נבצע הדבקות מכוונות בשתילים (צירופים שונים של כנות ורכבים) עליהם נמדוד את אורך הנגעים בהשוואה לביקורת לא מאולחת. 5 במקביל ,נבצע מעקב אחר התפתחות התסמינים וחומרתם במטעים מסחריים שנוגעו באופן טבעי ושבהם נטועים זנים שונים הגדלים זה בצד זה .הממצאים ישמשו לקביעת התגובה של זנים וכנות שונים לגורמי המחלה ועל פיהם נוכל לקבוע אם הנגיעות הפחותה של הזן האס במערכות הטבעיות נובעת מעמידות גנטית או מסיבות אחרות. 1.4 פיתוח ממשק גידול שיאפשר להתמודד עם המחלה ביעילות בארבעת מצבי הנגיעות שהוגדרו למעלה 1.2.2מתי ואיך לבצע סניטציה של רקמות סימפטומטיות ומה עושים עם הגזם? [חלק זה יתבצע בשנות המחקר הראשונה ,השנייה והשלישית באחריות דני שטיינברג ובהשתתפות סטנלי פרימן ,אלי סימנסקי ויונתן מעוז] במטעים בהם נראים תסמיני המחלה האופייניים קיימת התלבטות לגבי דרכי הפעולה המיטביות ולגבי מועד הפעולה (אם הוחלט לבצעה) :האם להסיר את הענפים המתייבשים או לחילופין האם עדיף לא לגעת בעצים כלל ולהשאיר את הענפים המתייבשים עליהם? במידה והוחלט להסיר את הענפים המתייבשים ,האם עדיף לעשות זאת עם זיהוי התחלת ההתייבשות או שכדאי להמתין עד שלא יהיה יותר שינוי בעוצמת ההתייבשות .בנוסף ,צריך להחליט באם להסיר ולהרחיק רק את האזורים הפגועים או שצריך להרחיק את כל הענפים שנראים עליהם תסמיני נגיעות (הפרשה של פרסיטול – חומר סוכרי לבן המופרש במקום ההדבקה) גם אם הענף עדיין ירוק ולא מתייבש .במקרים אלה צריך יהיה לבצע גיזום עמוק ,לעיתים עד כדי שילוד של העצים .כדי לבחון ולהגדיר את הפעולה המיטבית נבצע ניסויים במטעים המשתייכים לדרגת נגיעות ב' ו – ג' (מטעים בנגיעות נמוכה ובנגיעות בינונית ,בהתאמה) שצוינו בסעיף 2למעלה .במטעים יבוצעו ניסויים שיכללו שני טיפולים :היקש (ללא הרחקת הענפים הנגועים) וסניטציה (הרחקת הענפים הנגועים) .הסניטציה תבוצע לאחר זיהוי תסמיני ההתייבשות, במועדים שיקבעו על פי הצורך .כל חלקת ניסוי תכלול 1עצים לאורך שורה .הסניטציה תבוצע במשך שנתיים רצופות ויעילות הטיפול תקבע בשנה השלישית .ניסויים אחרים יועמדו גם במטעים המשתייכים לדרגת נגיעות ד' (נגיעות גבוהה) .במקרה זה נבחן את היעילות של שילוד שיבוצע בעצים הנגועים .במקרה זה יחידת הניסוי יהיה עץ בודד וכל טיפול (היקש ושילוד יכלול 2עצים (חזרות) .יעילות הטיפולים תקבע על פי גודל העצים ,עוצמת התסמינים ומספר הפירות שיהיו על העצים המטופלים בשנה השלישית. לאחר ביצוע סניטציה מצטבר במטעים חומר צמחי רב שעל חלק ממנו נמצאים ,לכאורה ,גופי הריבוי של הפתוגנים מחוללי המחלה .נשאלת השאלה מה דרך הטיפול המיטבית בחומר הצמחי הפגוע? האם ניתן לרסקו במטע ולהשאיר את הרסק שם או שיש להרחיק את הגזם ולהוציאו את מחוץ למטע ישם לטמון או לשרוף אותו .כמובן שהפעולה הפשוטה ביותר לביצוע מבניה לוגיסטית היא לרסק את הגזם במטע עצמו .כדי לבחון אם פעולה זו לא מסכנת את המטע בגלל שגופי הריבוי של הפטריות נשארים במטע נבצע ניסויים בהם נקבע את מידת ההישרדות של הפת וגנים בחומר נגוע שעבר ריסוק בכלים מסחריים .הניסויים יבוצעו במטעים שנוגעו בצורה טבעית מאזור מח"ע בדרום ועד אזור עמק זבולון בצפון .נבצע ניסויים באזורים שונים מפני שקיימים הבדלים בתנאי הסביבה (כמו סוג הקרקע ,הטמפרטורות וכמות הגשמים) בי האזורים השונים .בכל מטע נגזום ענפים נגועים ונרסקם בכלי ריסוק מסחריים .לאחר מכן נאסוף את קטעי הענפים המרוסקים ונכניס אותם לשקיות רשת בגודל 11 × 11סמ'. נשאיר חלק מהשקיות במטע עצמו (על פני הקרקע או שנטמינן בתוך הקרקע) ונעביר שקיות אחרות יועברו למינהל המחקר החקלאי בבית דגן .במינהל נשמור חלק מהן בחדר גידול בטמפרטורה קבועה של 11מעלות וחלקן יונחו בחוץ (על פני הקרקע ובתוכה) .במועדים שונים לאחר התחלת הניסויים ידגמו שאריות גזם מהשקיות שהוצעו במקומות השונים וננסה לבודד מהם את גורם המחלה .הממצאים יאפשרו לקבוע כמה זמן שורד גורם המחלה בגזם ו האם תנאי הסביבה ומקום הגזם (על או בתוך הקרקע) משפיעים על הישרדות גורמי המחלה .הממצאים יאפשרו להגדיר את הטיפול המיטבי בגזם מבחינת הסיכון למטע. 1.2.1האם ניתן למנוע את ההחמרה בעוצמת הנזק אותו גורמת המחלה בעצים נגועים? [חלק זה יתבצע בשנות המחקר הראשונה ,השנייה והשלישית באחריות דני שטיינברג ובהשתתפות אלי סימנסקי ,יונתן מעוז ואנשי חברת לוכסמבורג] בניסויים שבצענו במח"ע לפני ההגשה של תוכנית מחקר זו בחנו את האפשרות שיישום התכשיר קנון ישפר את בריאות עצי האבוקדו הנגועים במחלת הבוטריוספריה .התכשיר קנון מכיל אשלגן זרחיתי; חומר זה הוא בעל פעילות אנטי-פטרייתית כנגד כמה מיני פטריות (כמו פיטופתורה) אך אינו קוטל פטריות מקבוצות אחרות .אבל, התכשיר מעורר את מערכות ההגנה הטבעיות הקיימות בצמחים וישומו עשוי להפחית את עוצמת הנגיעות גם של פטריות שכנגדן אין לו פעילות ישירה .ממצאים ראשוניים של הניסויים שבצענו במח"ע היו חיוביים והצביעו על השפעה חיובית של התכשיר .בשיתוף עם חברת לוכסמבורג (המשווקת את התכשיר קנון) אנו מתכוונים לבצע ניסויים במטעים מבוגרים שנראו בהם תסמיני המחלה בארבע רמות הנגיעות שצוינו בסעיף 2למעלה .במטעים המשתייכים לדרגת נגיעות א ,ב ,ג (מטעים בריאים ,בנגיעות נמוכה ובנגיעות בינונית ,בהתאמה) יבוצעו ניסויים שיכללו שני טיפולים :היקש והגמעה של קנון .במטעים המשתייכים לדרגת נגיעות ד' (נגיעות גבוהה) הניסויים 6 יועמדו אחרי ביצוע סניטציה קפדנית ויכללו ארבעה טיפולים במתכונת של חלקות מפוצלות .בחלקות הראשיות הטיפולים היקש והגמעה של קנון; בחלקות המשנה (עצים בודדים בתוך כל חלקה ראשית) טיפולי הזרקה של קנון שיכללו טיפול היקש (ללא הזרקה) וטיפול של הזרקה .ההגמעה תתבצע על ידי המגדלים בסיוע אנשי לוכסמבורג; ההזרקה תתבצע על ידי אנשי לוכסמבורג .ניסויים בכל אחת מרמות הנגיעות אנחנו מתכוונים לבצע 2-1ניסויים ובסך הכל 1-8 ,ניסויים .הטיפולים ייושמו במשך שנתיים ברציפות ובמהלך תקופה זו נבצע מעקב אחר הופעת תסמיני המחלה וחומרתם .כפי שצוין ,הטיפול בקנון לא אמור "לרפא" את העצים הנגועים; אם הוא יהיה יעיל, הוא יעכב ואולי ימנע את ההחמרה בעוצמת התסמינים. 1.2.2איך אפשר להגן על העצים ולמנוע את ההתרחשות של הדבקות חדשות? [חלק זה יתבצע בשנות המחקר השנייה והשלישית באחריות דני שטיינברג ובהשתתפות אלי סימנסקי ויונתן מעוז] בשנות המחקר השנייה והשלישית נבצע במטעי אבוקדו ניסויים בהם נבחן את האפשרות להגן על העצים בפני התרחשות של הדבקות חדשות .הניסויים יבוצעו במטעים בהם קיימת נגיעות גבוהה ובמטעים בהם קיימת נגיעות בינונית .כל ניסוי יכלול ארבעה טיפולים ויוצב במתכונת של ניסוי דו-גורמי .הגורם הראשון יהיה טיפולי סניטציה והוא יכלול שתי רמות (עם וללא סניטציה) .הגורם השני יהיה טיפול ריסוס וגם הוא יכלול שתי רמות (עם וללא ריסוס) .תכשירי ההדברה בהם נשתמש יהיו תכשירי ההדברה היעילים ביותר שימצאו במסגרת מיזם חוס"ן בוטריוספריה והם יישומו לסירוגין .המטרה תהיה להגן על הענפים הבריאים בפני הדבקה .בחלק מהניסויים ניישם את תכשירי ההדברה מידי שבועיים במהלך החורף ובניסויים אחרים ניישם את תכשירי ההדברה מיד לאחר ירידת גשמים .את יעילות הטיפולים נקבע על פי מידת הפגיעה של העצים במחלה. .5 לוח זמנים לביצוע המחקר נושא האפידמיולוגיה של גורם המחלה והגורמים המשפיעים על התפתחותו יחסי הגומלין פתוגן - פונדקאי פיתוח ממשק גידול שיאפשר להתמודד עם המחלה שאלות מחקר מה מקורות המידבק הראשוני? מתי מתרחשות ההדבקות המשניות ואיך מופץ גורם המחלה במרחב? מה הגורמים המשפיעים על ההחמרה בנגיעות? באילו רקמות מתפתחת הפטרייה? מה מנגנון ההשפעה של המחלה על הצמחים? האם יש שונות תגובת זנים וכנות לפתוגן? מתי לבצע סניטציה ומה עושים עם הגזם? איך למנוע את ההחמרה בעוצמת הנזק הנגרם בעצים נגועים? איך ניתן להגן על העצים? שנת מחקר ב א X X X X X X X X X X X X X X X תקציב מחקר מבוקש .6 היקף התקציב המבוקש לחוקרים במינהל המחקר החקלאי עבור כל המחקר הוא ₪ 201,111לשנה סכום זה לא כולל את עלות העבודה של אלי סימנסקי ויונתן מעוז .שכרם ימומן על ידי מועצת הצמחים ויועבר אליהם ישירות באחריות מועצת הצמחים .היקף מעורבותם במחקר יהיה 10ימי עבודה בשנה (שני ימי עבודה בחודש בממוצע). 7 ג X X X X X
© Copyright 2024