‫דרישות תזונתיות בחיידקים‬ ‫ – כל התהליכים הכימיים המתרחשים בתוך התא‬Metabolism Anabolism- the sum of all biosynthetic reactions in the cell ‫אנרגיה נצרכת‬ Catabolism- biochemical reactions leading to the production of usable energy (usually ATP) by the cell ‫אנרגיה משתחררת‬ All cells require energy and a means to trap it Metabolic options for obtaining energy Troph-food Auto – self Hetero-other Reduced Reduced ‫חימצון‬ Metabolic diversity •Phototrophs: energy is obtained from light •Photoauthotrophs: carbon is obtained by fixing CO2 (most cyanobacteria, photosynthetic bacteria) •Photoheterotrophs: carbon is obtained from organic compounds (Purple nonsulfur bacteria, halophilic Archaea) •Chemotrophs: energy is obtained from chemicals • Chemolithoautotrophs (rock feeders): energy is obtained from inorganic chemicals (sulfur,iron,hydrogen) carbon is obtained by fixing CO2 (sulfur-reducing Archaea, methanogens) •Chemoorganotrophs or Chemoheterotrophs: carbon and energy are obtained from organic chemicals (E. coli, pathogens) -‫כימוליטואוטוטרופ‬ ‫ – משתמשים בחומר אנאורגני מחוזר כמקור‬mixotroph -‫כימוליטוהטרוטרופ‬ Beggiatoa ‫לאנרגיה ובחומר אורגני כמקור פחמן )לביוסינטזה( לדוגמא‬ Mixotroph - An organism able to assimilate organic compounds as carbon sources while using inorganic compounds as electron donors ‫‪Chemoorganotrophs or Chemoheterotrophs‬‬ ‫•החיידקים לגביהם נצבר הידע הראשוני הרב ביותר‬ ‫•עם חיידקים אלו נעבוד במעבדה‬ Microbial Nutrition ‫‪Chemoheterotrophs‬‬ ‫הרכב תא החיידק‬ ‫תא פשוט של קולי‬ ‫בנוי מכ‪5,000 -‬‬ ‫תרכובות שונות אך‬ ‫זקוק לתרכובות‬ ‫מועטות יחסית על‬ ‫מנת לסנטז אותן‬ ‫מקורות‬ ‫מזון – ‪NUTRIENTS‬‬ ‫חיידקים שונים זקוקים לחומרי הזנה שונים ובכמויות שונות‬ ‫‪ - Macronutrients‬דרושים בכמויות גדולות – בעיקר ‪ CHNOPS‬וכן‬ ‫בכמויות קטנות יותר ‪K, Mg, Na,Ca, Fe -‬‬ ‫)‪ -Micronutrients (Trace elements‬דרושים בכמויות קטנות‬ ‫‪ -Growth factors‬תרכובות אורגניות נדרשות בכמויות מזעריות‬ ‫)פורינים‪,‬פירימידינים‪,‬חומצות אמינו‪ ,‬ויטמינים( רב המיקרואורגניזמים‬ ‫יכולים לסנטז לבד‪.‬‬ ‫‪ - Macronutrients‬דרושים בכמויות גדולות‬ Iron (‫מסיס )תנאים אנאירוביים‬ (‫לא מסיס )תנאים אירוביים‬ ferrous -Fe+2 ferric -Fe+3 Siderophores – Iron binding agents Ferric Enterobactin E. coli ‫חמצן‬ ‫– ‪- Aquachelin‬בחיידקים ימיים‬ ‫באוקיינוס‪ -‬ריכוז מאד נמוך של ברזל – ‪ 1‬פיקוגרם = ‪ 10-12‬גרם‬ ‫)‪Micronutrients (Trace Elements‬‬ ‫דרושים בכמויות קטנות מתכות‪ ,‬לרובם תפקיד במבנה אנזימים‬ ‫מאחר והדרישה למיקרואלמנטים נמוכה מאד לעיתים‪ ,‬בתרבית מעבדתית אין צורך להוסיפם‬ ‫למצע גידול‬ Growth Factors ‫‪Growth factors‬‬ ‫תרכובות אורגניות הנדרשות בכמויות מזעריות‬ ‫רב המיקרואורגניזמים מסוגלים לסנטז לבד‪ .‬מיקרואורגניזמים מעטים זקוקים‬ ‫לתרכובת אחת או שתיים‬ ‫פורינים‪,‬פירימידינים‪,‬חומצות אמינו‪ ,‬ויטמינים‬ ‫וויטמינים – קו‪-‬אנזימים‬ ‫בעיקר נדרשים‪ -‬תיאמין )‪ ,(B1‬ביוטין‪ ,‬פירידוקסין )‪ ,(B6‬וקובלאמין )‪.(B12‬‬ ‫סיכום‬ ‫•מאות התרכובות הכימיות המצויות בתוך התאים החיים‬ ‫נוצרים מאבני בנין הקרויים נוטריאנטים‬ ‫•חומרים אותם צורך התא בכמויות יחסית גדולות‬ ‫נקראים מאקרונוטריאנטים‬ ‫•חומרים אותם צורך התא בכמויות מזעריות קרויים‬ ‫מיקרונוטריאנטים )במקרה של מתכות( או פקטור גדילה‬ ‫)במקרה של תרכובות אורגניות(‬ Culture Media ‫מצעי גידול‬ ‫‪ .1‬לפי הרכב‪ -‬מוגדר‪ ,‬מורכב )=בלתי מוגדר(‪) ,‬וגם‪ :‬מינימלי‪,‬‬ ‫עשיר(‬ ‫‪ .2‬לפי מירקם‪ -‬מצע נוזלי‪ ,‬מוצק‪ ,‬מוצק למחצה‬ ‫‪ .3‬לפי ייעוד‪ -‬מצע סלקטיבי‪ ,‬דיפרנציאלי‪ ,‬העשרה‬ ‫•על מנת לגדל חיידק מסוים יש לדעת לאיזו קבוצה הוא שייך‬ ‫•פוטואאוטוטרופ‪ ,‬פוטוהטרוטרופ‪ ,‬כמואאוטוטרופ‪ ,‬כמוהטרוטרופ‬ ‫ מורכב‬,‫ מוגדר‬-‫ לפי הרכב‬.1 Lactic acid bacteria ‫‪ .2‬מצע גידול לפי מירקם‪-‬‬ ‫מצע נוזלי‪ ,‬מוצק‪ ,‬מוצק למחצה‬ ‫אגר – פולימר מופק מאצות אדומיות‬ ‫זריעת בידוד‬ ‫פיזור חיידקים על גבי צלחת )מדגימה שלא תעלה על ‪100-200‬‬ ‫חיידקים חיים(‬ ‫אוכלוסיה מעורבת‬ ‫מושבה בודדת‬ ‫תרבית טהורה )מושבה בודדת – העברה למצע מוצק או נוזלי(‬ ‫זריעת בידוד‬ ‫‪ .3‬מצע גידול לפי ייעוד‪ -‬מצע העשרה‪ ,‬סלקטיבי‪ ,‬דיפרנציאלי‬ ‫העשרה –‬ ‫העשרה של מין או מיני חיידקים מתוך אוכלוסיה מעורבת‬ ‫נעשית בד"כ במצע נוזלי‬ ‫)חיידקים מפרקי נפט‪ ,‬חיידקים מפרקי צלולוז‪(V. cholerae ,‬‬ ‫העשרה‬ Beijerinck Martinus 1851-1931 The isolation of Azotobacter ‫המשך‪...‬‬ ‫‪ .3‬מצע גידול לפי ייעוד‪ -‬מצע העשרה‪ ,‬סלקטיבי‪ ,‬דיפרנציאלי‬ ‫סלקטיבי ‪ +‬דיפרנציאלי‬ ‫‪ MacConky‬מכיל קריסטל ויולט המונע גידול רב גרם חיוביים‬ ‫ומלחי מרה למניעת גידול גרם שליליים שאינם חיידקי מעיים‬ ‫דיפרנציאלי‪-‬‬ ‫דם‪ ,‬התססת סוכרים‬ ‫דיפרנציאלי‪ -‬דם‬ ‫ דיפרנציאלי‬+ ‫סלקטיבי‬ Mackonkey Escherichia coli Salmonella typhimurium Lactose Fermentation: positive Lactose Fermentation: negative pink colonies (colorless colonies) neutral red, a pH indicator. pH below 6.8, pinkish-red ‫הערכת גודל אוכלוסיה‬ ‫שיטות ישירות‪:‬‬ ‫‪ .1‬ספירה במיקרוסקופ בעזרת תא ספירה‬ ‫‪ .2‬ספירה חיה‬ ‫הערכת מספר חיידקים בדוגמא מהטבע‬ ‫שיטות עקיפות‪:‬‬ ‫‪ .1‬מדידת מרכיבי תא כימיים‪ ,‬למשל חלבונים‪ ,‬מדידת משקל‬ ‫יבש‬ ‫‪ .2‬הערכת מספר התאים על ידי מדידת עכירות התרחיף‬ ‫– ‪ OD‬או ‪Klett units‬‬ ‫‪Klett units=OD/0.002‬‬ ‫שיטות ישירות‪:‬‬ ‫ספירה במיקרוסקופ בעזרת תא ספירה‬ ‫במקרה של תא הספירה שלנו במעבדה – נפח משבצת‬ ‫=‪ 5*10-8‬מ"ל‬ ‫לכן על מנת למצוא כמות תאים למ"ל יש להכפיל את כמות התאים שנספרו לתא ב‪2*107 -‬‬ ‫שיטות ישירות‪:‬‬ viable counts :‫שיטות ישירות‬ ‫שיטות עקיפות‬ ‫‪Microbial growth‬‬ ‫גדילה‪ :‬עליה במספר התאים‬ ‫חלוקה בינרית‪ :‬מתא אחד נוצרים ‪ 2‬תאים‬ ‫גדילה ‪ -‬התרבות מספר התאים‬ ‫זמן דור‪ :‬הזמן הלוקח לתא אחד להפוך לשני תאים‬ ‫=הכפלת מספר התאים באוכלוסיה‬ ‫)גם המסה שלהם(‬ The rate of growth of a microbial culture Method of estimating the generation times ‫ זמן דור‬g= t/n n=t/g N=N02n 0.301 Slope=-------g Typical growth curve for a bacterial population ‫עקומת גידול‬ Chemostatcontinuous culture device ‫בכימוסטט‪:‬‬ ‫צפיפות האוכלוסיה וקצב הגידול מבוקרים‬ ‫גורמים חשובים בבקרת הכימוסטט‪:‬‬ ‫‪ .1‬קצב מיהול החיידקים‬ ‫‪ .2‬ריכוז מגביל של אחד הנוטריאנטים‬ ‫העלאת ריכוז הנוטריאנט המוגבל – העלאה בצפיפות האוכלוסיה‬ ‫העלאת קצב המיהול – העלאת קצב הגידול‬ ‫‪ – Aerobes‬משתמשים בחמצן כמקבל אלקטרונים בנשימה‬ ‫‪An organism that is capable of using oxygen as a terminal‬‬ ‫‪electron acceptor‬‬ ‫‪ – Obligate‬אירובים מוחלטים‪ ,‬לא יכולים להתקיים ללא חמצן‬ ‫‪ – Microaerophiles‬אאירובים הזקוקים לחמצן אך בכמויות קטנות יותר‬ ‫מנוכחותו באוויר‬ ‫‪ -Facultative‬חלק גדול מהאירוביים הוא פקולטטיבי כלומר בתנאי מזון‬ ‫מסוימים יכול להתקיים עם חמצן וללא חמצן‬ ‫‪ – Anaerobes‬לא יכולים להשתמש בחמצן כמקבל אלקטרונים בנשימה‬ ‫‪ – Aerotolerant anaerobes‬יכולים לגדול בנוכחות חמצן אך לא‬ ‫להשתמש בו כמקבל אלקטרונים‬ ‫‪ – Obligate / strict anaerobes‬אנאירוביים מוחלטים ‪ -‬מעוכבים ו‪/‬או‬ ‫מתים בנוכחות חמצן‬ ‫תנאים לגידול חיידקים אירוביים‪:‬‬ ‫הכנסת חמצן על ידי טיטול או הכנסת אוויר למדיום הגידול‬ ‫דוגמאות לתנאים לגידול חיידקים אנאירוביים‪:‬‬ ‫‪ .1‬מבחנות מלאות לחלוטין במצע ופקוקות היטב‪) .‬רק לחיידקים‬ ‫היכולים לשאת עקבות חמצן(‪.‬‬ ‫‪ .2‬מצע המכיל חומרים מחזרים‬ ‫לדוגמא‪Thioglycolate Medium :‬‬ ‫‪ .3‬גידול חיידקים במיכל ללא חמצן – ‪Anoxic jar‬‬ ‫‪ .1‬מבחנות מלאות לחלוטין במצע ופקוקות היטב‪) .‬רק לחיידקים‬ ‫היכולים לשאת עקבות חמצן(‪.‬‬ ‫גידול חיידקים‬ ‫באגר גבוה‬ ‫ביצוע וצילום‪:‬‬ ‫מיכל בסט‬ ‫ואריאלה‬ ‫וישליצקי‬ ‫קצה‬ ‫גידול‬ ‫חיידק‬ ‫אירובי‬ ‫חיידק‬ ‫אנאירובי‬ ‫?‬ ‫?‬ ‫חידק‬ ‫אנאירובי‬ ‫פקולטטיבי‬ ‫‪.2‬מצע המכיל חומרים מחזרים‬ ‫‪Thioglycolate broth culture medium‬‬ ‫‪resazurin‬‬ ‫אינדיקטור לחמצון‪/‬חיזור‬ ‫טיוגליקולאט מחזר ציסטין לציסטאין‪ .‬הציסטאין מתחמצן ע"י החמצן במצע חזרה‬ ‫לציסטין תוך יצירת מולקולת מים )וכך נתפס החמצן מהאויר(‪.‬‬ ‫גידול חידקים במצע טיוגליקולט‬ ‫)תנאים אנאירוביים בעזרת‬ ‫חומרים מחזרים(‬ ‫חידק‬ ‫אירובי‬ ‫חידק‬ ‫אנאירובי‬ ‫צילום וביצוע‪:‬‬ ‫מיכל בסט‬ Anoxic jar – ‫ גידול חיידקים במיכל ללא חמצן‬.3 A chemical reaction in the envelope in the jar generates H2 + CO2. The H2 reacts with O2 in the jar on the surface of a palladium (Pd) catalyst to yield H2O. The final atmosphere contains N2, H2, and CO2. ‫אינדיקטור – מתילן כחול‬ ‫חסר צבע בהעדר חמצן‬ ‫חיידקים כמו מתנוגנים מתים בנוכחות חמצן וכל הטיפול בהם חייב להעשות בתנאים‬ ‫אנאירוביים‪ .‬התא מכיל גז מימן או חנקן‪.‬‬ ‫‪Clostridium‬‬ ‫מינים השייכים לסוג ‪ clostridium‬הינם אנאירובים מוחלטים‬ ‫חיידק גרם חיובי יוצר ספורות וטוקסינים‬ ‫‪Clostridium tetani‬‬ ‫‪C. Perfingens, C. botulinum.‬‬ ‫צורות רעילות של חמצן‪:‬‬ ‫תוצרי הלוואי של חיזור חמצן למים בתהליך הנשימה‬ ‫‪ . Singlet oxygen (1 O2‬הצורה הטוקסית ביותר של חמצן‪ .‬נוצר בין השאר‬ ‫על ידי אור ומנוטרל בחידקים פוטוסינטטיים על ידי פגמנט קרטנואיד‬ ‫‪Enzymes that destroy toxic oxygen species‬‬ ‫אנזים זה התגלה בחיידקים אנאירוביים )ארכיאה( שנחשבו אובליגטוריים‪ ,‬לא משחרר חמצן חופשי‬ ‫‪Pyrococcus furiosus‬‬ ‫מי חמצן מתפרקים על ידי אנזים הדומה לפראוקסידז )ללא שיחרור חמצן(‬ ‫סופראוקסיד דיסמוטז‬ ‫•אנזים חיוני לכל חידק החי בתנאים אווירניים‬ ‫•חיידק החסר אנזים זה הוא אנאירוב אובליגטורי‬ ‫•אירובים ואירובים פקולטטיבים מכילים את שני האנזימים סופראוקסיד דיסמוטז‬ ‫וקטלז )להוציא מספר אאירובים אובליגטורים שאינם מכילים קטלז(‬ ‫•במינים של חיידקים אנאירובים אירוטולרנטיים כמו חיידקי ח‪ .‬לאקטית חסר‬ ‫אנזים זה אך נמצא כי יש להם מולקולה מורכבת המכילה מנגן )לא חלבון(‬ ‫הקושרת את היון סופראוקסיד והופך אותו דרך מימן פראוקסיד למים וחמצן‪.‬‬ ‫סופראוקסיד רדוקטז‪-‬‬ ‫כנראה נפוץ בקרב אנאירובים אובליגטורים יותר ממה שחשבו בעבר‪.‬‬ ‫נמצא דמיון ע"י סריקה גנומית‪.‬‬ ‫יתכן כי רגישות חיידקים אלו לסביבה אירובית היא מסיבות אחרות‬ ‫ולאו דווקא חוסר יכולתם להתמודד עם תרכובות טוקסיות של חמצן‬ Method for testing a microbial culture for the presence of catalase bubbles are O2 30% H2O2 Distribution of superoxide dismutase, catalase and peroxidase in procaryotes with different O2 tolerances. Superoxide dismutase Catalase Peroxidase Obligate aerobes facultative aerobes (e.g. Enterics) + + - Most aerotolerant anaerobes (e.g. Streptococci) + - + Obligate anaerobes (e.g. Clostridia, Methanogens, Bacteroides) - - - Group