מודיפיקציה ובקוע של פפעידים וחלבונים ליד שיירי ציסגואין
דד
מ ו ד י פ י ק צ י ה ו ב ק ו ע של פ פ ע י ד י ם ו ח ל ב ו נ י ם
ליד שיירי ציסגואין
ח»בור ל ש ם ק ב ל ת ה ת ו א ר
לפילוסופיה
דוקטור
מאת
<א < ר
ד ג נ<
ה ו ג ט ל מ ו ע צ ה ה מ ד ע י ת ש ל מכון ויצמן ל מ ד ע ,
זזשוו .תש׳׳ל
וחומת
מ ו ד י פ י ק צ י ה ו ב ק ו ע של פ פ ט י ד י ם ו ח ל ב ו נ י ם
ליד שיירי ציקגואיו
ח»בור ל ש ם ק ב ל ת ה ת ו א ר
לפילוסופיה
דוקטור
מאת
»א<ר
דגני
הוגש ל מ ו ע צ ה ה מ ד ע י ת של מכון ו»צמן ל מ ד ע ,ר ח ו ב ו ת
דושין .תש׳׳ל
מס׳ מערכת :1YSTEM NO.
עבודה
של
זו
נעשתה ב ה ד ר כ ת ו
מ ר ו ' 8אברהם
במחלקה
מכון
מציורניק
לביופיסיקה
ו יצפן למדע,
רחובות.
תודתי נתונה למדום׳ אבדחס פ ג י ו ד נ י ק
על הדרכתו תמסורת
ועזרתו חמתפדת.
הענינים
תוכן
עמוד
-
פרק אי*
.I
מבוא
ה מ ב נ ה ה ר א ש ו נ י של
.II
ביקוע כימי
.III
פרק ב'
1
חלבונים
של ק ש ר י ם
וקביעתו
פפטידיים
1
4
)סקירת הספרות(
)(1
ב י ק ו ע על י ד י
א י נ ט ר א ק צ י ה עם מ ר כ ז
א ל ק מ ר ו פ י ל י בשרשרת ה צ ד ד י ת
4
)(2
ב י ק ו ע על י ד י
א י נ ט ר א ק צ י ה עם מ ר כ ז
נ ו ק ל י א ו פ י ל י בשרשרת ה צ ד ד י ת
14
)(3
ב י ק ו ע קשרים
)(4
ב י ק ו ע השרשרת ה פ פ ט י ד י ת ב פ ח מ ן >> של ש י י ר ה ח ו מ צ ה ה א מ י נ י ת
א מ י ד י י ם ש ל י ש ו נ י י ם על
י ד י התקפה ב י מ ו ל ק ו ל ר י ת
22
מטרת ה ע ב ו ד ה
-
25
ביקוע שרשרות פפמידיות ליד שיירי ציסטאיז ע״י הפיכתן לנגזרות
26
דהידרואלנין
,1
הפיכת שיירי
.1
.2
.3
נםיונות בקבוצות
.2
56
בנוכחות שיירי
דיסולפיד
ציסטין
ו SIJNP -
26
בטמפרטורה
ע ו ז ב ו ת אחרות
31
33
א.
הקבוצה ה - S -פ י ק ר י ל י ת
33
ב.
הקבוצה הדנםילית
40
ד י ס ו ל פ י ד והשפעתן על ק ב ו צ ו ת
SWP
44
א.
חיזור
45
ב.
חמצון
46
ג.
סולפיטוליזה
47
^•פירוביל
52
ב י ק ו ע קשרי
.1
ציסטאין
לשיירי
דהידרואלנין
ת ל ו ת מ ה י ר ו ת ה א ל י מ נ צ י ה של ק ב ו צ ו ת
מ ו ד י פ י ק צ י ו ת של ק ב ו צ ו ת
.II
20
על י ד י מי חמצן א ל ק ל י י ם
על י ד י
2,2׳-דיאמינו-דיפנילאמין
DADPA
52
)
5
5
)DADPA
עמוד
ק
קבוצות
^ פ י ר ו ב י ל י ו ת על
ידי
.3
.III
59
.2
.3
פרק
.1
.II
.III
73
73
חלבון
78
ו י ר ו ם מ ו ז א י ק ה הטבק
)
0
8
82
- Nאציל-ציםטאין
ציסטאין
ריבונוקליאזה
88
89
90
91
חלק נ ס י ו נ י
חומרים
נסויים
ע-פירוביל-פפטידים
66
69
>-°כימוטריפםין
דיון
מכשירים
-3דיניטרופניל-ציסטאין
ריבונוקליאזה
ב י ק ו ע קשרי
-
62
ציםטאיניל ב ת ל ב ו נ י ם
נ ם י ו נ ו ת לביקוע
.III
.1
ב ב י ק ו ע פפטידי
וקביעה אוטומטית של
ביקוע הריפפטידים מכילי
.II
פרק
ומנגגונה
דיון
-
ד*
ד.
השימוש ב DADPA -
שיטה להפרדה
.1
'1
ג.
זיהוי
ח י ת ו ך קשרי
.IV
תוצר הראקציה
DADPA
93
93
ושיטות כ ל ל י ו ת
99
102
קיצורים
118
סיכום
119
ספרות
123
תקציר
אנגלי
)TMV
פ ר ק אי*
.1
קביעת
ה מ ב נ ה ה ר א ש ו נ י של ח ל ב ו נ י ם ו ק ב י ע ת ו
הביולוגית״
ה ב י ו ל ו ג י ת של ה ח ל ב ו נ י ם .
השלישוני(.
הפעיל"
האחראי
ס ד ר ז ה מ כ י ל ב ת ו כ ו את ה א י נ פ ו ר מ צ י ה ה י ו צ ר ת את מ ב נ ה ו ה ת ל ת מ מ ד י
בחלבונים הפועלים
לפעולתו
היו
מאפשרים,
הראשוני
).(1
וקשרים
ה ר א ש ו נ י י ם על מספר ה ח ל ב ו נ י ם
האמיניות
על פ ע י ל ו ת ו
החלבונית
אשר ש ל מ ו ת מ ב נ ם ה ר א ש ו נ י
מפת
),3
.(2
ו פ ת ו ח אמצעי החישוב ה נ ח ו צ י ם ,
ה ת ל ת -מ מ ד י על ה ח ל ב ו ן מ ת ו ך
הומולוגיים
ידיעת מבנהו
גנטיים
ואבולוציוניים.
ידיעת
י כ ו ל ה ל ל מ ד על ת ו ל ד ו ת ה ת פ ת ח ו ת ה א ו ר ג נ י ז מ י ם
ממחקרים ה ש ו א ת י י ם אלה
ה ב י ו ל ו ג י ת של ה ח ל ב ו ן ,
החומצות האמיניות שניתן
ידיעת
כחצי
חוליותיה השונות
מ ה ו ו ה ת ר ג ו ם י ש י ר ע ל מ ב נ ה ה ג ן אשר י צ ר את ה ח ל ב ו ן ,
המנןנתזים
בשמח
היכולים להתקיים בין
ה מ ב נ י ם ה ר א ש ו נ י י ם של ח ל ב ו נ י ם ח ש ו ב ה ג ם ל מ ח ק ר י ם
ח ל ב ו נ י ם אלה
שיירי
הידרופוביים,
הקונפיגורציה היציבה
י ד י ה ש ק ו ל של כ ל ה כ ו ח ו ת ה א י נ ט ר א מ ו -
י ד י ע ת מ ה ו ת ם ה מ פ ו ר ט ת של כ ו ח ו ת א ל ה ,
החומצות האמיניות בחלבון
המבניס
המבנה השלישוני הוא
ו ה י א נ ק ב ע ת על
ע ק ר ו נ י ל ק ב ו ע את מ ב נ ה ו
ז ה ה ו א ה י ו צ ר את ה ״ מ ר כ ז
גרידא.
ידיעת
סדר
באופן
ב א נ ז י מ י ם מ ב נ ה תלת ממדי
ה ק ט ל י ט י ת של ה א נ ז י ם .
כ ג ו ן קשרי מ י מ ן
של השרשרת ה ח ל ב ו נ י ת
) ה מ ב נ ה ה ר א ש ו נ י ( ה ו א אחד מ נ ו ש א י המחקר
ל א ח ר ו נ ה נ ת ג ב ש ה ה ד ע ה ש ס ד ר ז ה מ ה ו ה את ה מ פ ת ח ל פ ע ו ל ת ם
ב י ו ת ר של ה ח ל ב ו ן מ ב ח י נ ה ת ר מ ו ד י נ פ י ת ,
לוקולריים
-
ס ד ר ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת של ח ל ב ו נ י ם
ה ע י ק ר י י ם של ה כ י מ י ה
)המבנה
מבוא
כלומר
ניחן
תיונית לפעילותו
ניתן
ל ק ב ו ע מה הם
ה א ז ו ר י ם בשרשרת
ה ב י ו ל ו ג י ת של ה ח ל ב ו ן ,
ל ה ח ל י פ ם ב א ח ר י ם מ ב ל י שתפגע
ה מ ב נ ה ה ר א ש ו נ י חשובה גם ל צ ר כ י מ ח ק ר י
ל ל מ ו ד ג ם ע ל השפעת ס ד ר ה ח ו מ צ ו ת
יעילותו
ו מ א י י ר א ל ו הם
הפונקציונלית
קרסיטלוגרפיה בקרני
).(2
x -של ח ל ב ו נ י ם .
ז ה ה ו ש ג ו ב ש נ י ם ה א ח ר ו נ ו ת ה ש ג י ם ח ש ו ב י ם ו ע ד כ ה פ ו ע נ ח ו ב ש ל מ ו ת מ ב נ י ה ם ה ש ל י ש ו נ י י ם של
תריסר תלבונים
).(4
א ו ל ם מ ס י ב ו ת של מ ג ב ל ו ת -ר ז ו ל ו צ י ה ל א נ י ת ן
ה צ פ י פ ו ת ה א ל ק ט ר ו נ י ת של ח ל ב ו ן מ ב ל י ל ד ע ת ת ח י ל ה את מ ב נ ה ו
הראשוני.
ל פ ע נ ח ב מ ל ו א ה את
קביעת
שיירי
ה מ ב נ ה ה ר א ש ו נ י של שרשרת
ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ב א ח ד מ ק צ ו ת השרשרת,
לצורך
ד ג ר ד צ י ה נ י ת ן להשתמש ב א נ ז י מ י ם א ו
לויצין
-אמינו
ו8-
היא
פ ו ל י פ פ מ י ד י ת נ ע ש י ת על
הכימיות
ה א נ ז י מ י ם ה ע י ק ר י י ם הם
-פ פ ט י ד ז ה ל ד ג ר ד צ י ה מהקצה ה א מ י נ י של השרשרת
ל ד ג ר ד צ י ה מהקצה ה ק ר ב ו כ ם י ל י
רציפה
ו ז ה ו י ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת המשתחררות עקב כ ך .
בריאגנטים כימיים.
).(6
י ד י ד ג ר ד צ י ה ה ד ר ג ת י ת של
),(5
וקרבוכסיפפטידזות
ח ם ר ו ן השיטות ה א נ ז י מ ת י ו ת הוא בכך שהדגרדציה
ו מ ח י י ב ת א נ ל י ז ה ק י נ ט י ת של ה ו פ ע ת ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ה ח ו פ ש י ו ת .
ה ע ק ר י ו ת הן שיטת אדמן
)עם פ נ י ל
איזוחיוציאנט(
שיטות הדגרדציה
ל ד ג ר צ י ה מהקצה ה א מ י נ י
ושיטתו
).(10
ש י ט ת א ד מ ן ש ו כ ל ל ה ל א ח ר ו נ ה ב מ י ד ה ר ב ה עם פ י ת ו ח ו של " ס ק ו ו נ ט ו ר " א ו ט ו מ ט י
15.4
חומצות
ו א נ ה י ד ר י ד אצטי(
)(7-9
החדשה של ם מ ר ק ) ע ם א מ ו נ י ו ם ת י ו צ י א נ ט
מחזורי
ד ג ר ד צ י ה ב י מ מ ה ב נ י צ ו ל ת של S?98ב כ ל ש ל ג .
אמיניות
באפומיוגלובין
A
בעזרתו
ל ד ג ר ד צ י ה מהקצה ה ק ר ב ו כ ם י ל י
) (11ה מ ב צ ע
נ ק ב ע ה ס ד ר של 60ש י י ר י
).(11
ג י ש ה א ח ר ת ל ק ב י ע ת ה מ ב נ ה ה ר א ש ו נ י מ ב ו ס ס ת ע ל א נ ל י ז ה מ ם -ס פ ק ט ר ו מ ט ר י ת של ה פ ו ל י פ פ ט י ד
).(12
לאחר
בשיטה
סימון
ז ו מ ז ה י ם ב ס פ ק ט ר ו ם -ה מ ם ה את ה פ ר ג מ נ ט י ם מ כ י ל י -ה ק צ ה של ה פ ו ל י פ פ ט י ד ,
א י ז ו ט ו פ י מ ו ק ד ם ע ל קצה השרשרת.
ברם,
חרף ה ש כ ל ו ל י ם
ל מ ק ט ע י ם של ח ל ב ו נ י ם
והחידושים מ ו ג ב ל ו ת עדין השיטות השונות לקביעת המבנה הראשוני
ולפפטידים בעלי אורך מ ו ג ב ל .
מ ו ק ד ם של השרשרת ה ח ל ב ו נ י ת ל פ ר ג מ נ ט י ם ק צ ר י ם
ה מ ש ו ח ז ר של ה מ ו ל ק ו ל ה ה ש ל מ ה .
כוללים
בחי
או
בצומח
ידועים
אמיניות
אולם
)טריפםין
) פ פ א י ן ,פפסין" ץ א ל ם ט ז ה (
ללא ה ב ח נ ה .
קביעת המבנה הראשוני מחייבת איפא פרוק
יחסית,
ושבוץ מבניהם הראשוניים לתוך המבנה
מ ק ו ב ל להשתמש לשם כ ך ב א נ ז י מ י ם
אנזימי-יונקים םפיציפיים
הפפטידיים
וזאת
הבקוע האידיאלי
וכימוטריפםין(,
ואנזימים
פרוטיאוליטיים
).(13
אלה
א נ ז י מ י ם פחות ס פ צ י פ י י ם שמקורם
ב ק ט ר י ו ל ו ג י י ם ר ב י -ע צ מ ה ה מ פ ר ק י ם את ה ק ש ר י ם
ח י י ב ל פ ע ו ל ב מ ס פ ר מ צ ו מ צ ם של ק ש ר י ם
פפטידיים
מ ר א ש ,על מ נ ת ל ק ב ל מ ס פ ר ק ט ן כ כ ל האפשר של מ ק ט ע י ם ק ל י ם ל ה פ ר ד ה ו ה מ ס ת י מ י ם ב ח ו מ צ ו ת
שזהותן
צ פ ו י ה מראש.
גם ה א נ ז י ם ה ם פ י צ י פ י
ה א נ ז י מ י ם ה מ ת ק ר ב י ם ב י ו ת ר ל ד ר י ש ו ת א ל ה הם מ ד י פ ם י ן
ביותר,
ט ר י פ ם י ן ,מבקע שרשרות
ח ל ב ו נ י ו ת בקשרים ה C -
וכימוטריפםין
-פפטידיים
ב
של שני שיירי חומצות אמיניות :ליזין וארגינין.
בכמה מקרים הוגברה הסלקטיביות של
טריפםין על ידי שיטות מודיפיקציה שפותחו לשני שיירים אלה ,ואשר נועדו להגביל את
הקבוע האנזימחי לאחד משני סוגי הקשרים הפפטידיים.
כמה מהמודיפקציות של ליזין ,כגון
אצטאימידציה ) (14תריפלורואצטילציה ) ,(15דיתיוקרביפלציה ) (16אצטואצטילציה )(17
ומלאילציה ) ,(18הן רברסיבליות וניתן לשחזר מתוכן את שיירי הליזין לאחר הביקוע הטדיפטי
המבוכר של קשרי ארגינין.
לעומת זאת המודיפיקציות של שיירי אדגינין ,הנעשות בדיר כלל
על ידי ריאגנטים ^ - °דיקטוניים ) (19-23אינן רברםיבליות ,אינן כמותיות ואינן
ספיציפיות לחלוטין לשיירי ארגינין ..נוסף על מגבלות הספיציפיות של אנזימים פרוטיאו-
ליטיים מסתבך לעתים השימוש בבקוע האנזימתי כתוצאה מקיומן של דאקציות לואי כגון
טדנםפפטידציה ) (24ואוטוליזה ) ,(25וכן מאי יכולתם של פוליפפסידים ציקליים ושל קשרים
פפטידיים מסוימים כגון קשרי פרולין לעבור בקוע אנזימתי.
לאור מגבלות אלה התפתחה בשנים האחרונות גישה חדשה לבעית הבקוע הסלקטיבי של
שרשרות פוליפפטיות שנועדה להשלים ולהרחיב את גישת הבקוע האנזימתי.
גישה זו מבקשת
לנצל את הראקטיביות הכימית המיוחדח של שיירי חומצות אמיניות מסוימות על מנת לגרום
לבקוע הקשר הפפטידי באמצעות ריאגנטים כימיים לא-אנזימתיים.
לגישה זו כמה יתרונות״
קל יוחד לחקור את מנגנון הריאקציה בין הריאגנט המבקע
ובין שייר החומצה האמינית ,וממילא ניתן להכין ריאגנטים כימיים אנלוגים לפי הצורך ובכך
להגביר את מידת הסלקטיביות שלו.
הואיל והדיאגנט אינו חלבוני ניתן להשתמש בו בעודפים
גדולים מבלי לחשוש לזיהום המערכת בחומרים חלבוניים זרים.
כמו כן ניתן במקרים רבים
לפתח שיטת מעקב אחר מהלך המודיפיקציה והבקוע הכימיים ,על יסוד תכונותיו הכימיות של
הדיאגנט.
מאידך ,הדרישות מדיאגנט כימי סלקטיבי אשר כזה הינן חמורות למדי :עליו לבצע
את הריאקציה באופן כמותי ובתנאים עדינים ,כגון טמפרטורה נמוכה ותנאי
pH
לא קיצוניים.
עד כה פותחו מספר שיטות כימיות לבקוע ספציפי של שרשרות פוליפפטידיות ואחדות
אף זכו לשימוש חשוב בקביעת מבנים ראשוניים של חלבונים; אולם רק בודדות מתוכן עונות
על הדרישות האמורות.
השיטות הכימיות ייסקרו להלן.
- 4 -
.11
בקוע כימי של קשרים פפטידיים
)סקירת הספרות(
שיטות הבקוע הכימיות נסקרו כבר בחלקן ).(26-28
בדרך כלל מקובל למיין את
השיטות לפי סוגי שיירי החומצות האמיניות אשר קשריהן נבקעים.
להלן נסקור את שיטות
הביקוע תוך שימת דגש על סיווג מנגנוניהן הכימיים ,שכן דרך זו מבליטה יותר את אופין
של ריאקציות הביקוע,
את רוב הבקועים הכימיים הסלקטיביים ניתן לחלק לשלוש קבוצות עיקריות:
.1
בקוע השרשרת הפפטידית בקשר ה-
- Cאמידי או ה - N -אמידי של שייר
חומצה אמינית ,המבוסס על אינטראקציה אינטראמולקולרית ציקלית של הקשר
האמידי עם שייר החומצה האמינית שעבר מודיפיקציה.
.2
בקוע הקשר ה - N -אמידי על ידי התקפה נוקליאופילית בימולקולרית ישירה.
.3
בקוע השרשרת הפוליפפטידית״בפחמן oC -של שייר החומצה האמינית.
ניתן לחלקה לשתי תת-
קבוצה ;1
קבוצה זו מכילה את דוב ריאקציות הביקוע הידועות.
קבוצות:
) (1אינטראקציות בהן השרשרת הצדדית מכילה מרכז אלקטרופילי.
) (2אינטראקציות בהן השרשרת הצדדית מכילה מרכז נוקליאופילי.
המרכז האלקטרופילי או הנוקליאופילי מפחמן
ה - C -אמידי או ה - N -אמידי.
המרחק של
,הוא הקובע אם יבקע הקשר
אינטראקציות 1-5מועדפות בדרך כלל
על פני אינטראקציות ציקליות אחדות.
)(1
אינטראקציות ציקליות עם מרכז אלקטרופילי בשרשרת הצדדית
מרכז כזה יכול להיוצר על ידי קבוצה עוזבת מתאימה ) x
)א(
~x
<(.
נוכחותו של פחמן & -ן אלקטרופילי על השרשרת הצדדית מוליכה לאינטראקציה 1-5
עם החמצן הקדבונילי של הקשר ה - N -אמידי ,תוך יצירת טבעת אוקםזוליום הניתנת
להידרוליזה קלה.
־ - 5
>C
v
N H -
X
/. MEL
\
7
X
c
I
׳CH)(II
-
c
—•X
II
•CH
0
0
)(I
pH 2
0
0
C
3
^H 0
X
2
C
)(H+
NH
C
— CH
x
/
OH
— NH
pH 7
—NH
1
CH
2
c
II
CH 0H
5
2
0
)(V
)(III
HOCH,
2
N
)X = 0P0(0R
C H P h״OSO
2
2
)(IV
CN
0
זיודרו
ושמיר
) 2 9 - 3 0ה ר א ו את ק י ו ם
(
פ ו ם פ ו ר י ל י ו ת של ס ר י ז )
2
).(X=0P0(0R
ם ו ל פ ו נ י ו ת של א נ ז י מ י ם בעלי
Fh CH
2
המכיל את הקשר
0
בהחזרת הפעילות ה א נ ז י מ ט י ת .
אנזים.
לנגזרת
ס ו ל פ ו נ י ו ם עם
גרום
אואד
0
ציאנוגן
ווילקוקס
וחבריו
של הנגזורת ה -
נגזרת
באופן
ב-
זה חלה,
אותה אינטראקציה קימת בפפטידים של
תיוציאנט.
ואילו
pH
במרכז ה פ ע י ל .
ברומיד )
) (31השתמשו
כגון
-2
7
איפא,
-אצטיל
הציאנו-םולפוניום אלימינציה
- 0פניל
נוצר
pH
ונפתח
-מתיל
0
- Sמתיל
-
-סולפוניל
בIIהאוקסזולין
-
III
חל שחלוף V >— 111המלווה
ד י ם ו ל פ ו ק ם י ל צ י ה של ה -
0
-סולפוניל-
-צ י ס ט א י ז לאחר הפיכת הגפרית
, 3 ( X = S ( C N ) C Hכאשר הקבוצה העוזבת היא מתיל
בריאקציה להפיכת ש י י ר הציסטאין
) ( 3 2 - 3 3השתמשו בה לבקוע פ פ ט י ד י
-סרינית)111
כנגזרות
אינטראקציה דומה קיימת כ נ ג ז ר ו ת
לתוצר
-אםפרטיל-סרין
ה א י נ ט ר א ק צ י ה ! — ^ — II<V
ם ר י ן במרכז ה פ ע י ל ,
(.
CH
{ IV
לדהידרואלנין,
(,
צ י ס ט א י ן ,לאחד
לסדין
בגלוטתיון,
ה י ד ד ו ל י ז ה חומצית
י צ ו י ן שבטמפרטורות ג ב ו ה ו ת עוברת
במקום
ציקליזציה
לאוקסזולין.
-
)ב(
מרכז
הקשר ה -
א ל ק ט ר ו פ י ל י ה נ ו צ ר בעמדה > P
c
תוך
-אמידי
- 6
בשרשרת ה צ ד ד י ת ע ו ב ר א י נ ט ר א ק צ י ו ז
1-5עם
קרבוניל
יצירת א י מ י נ ו ל ק ט ו ן העובר ה י ד ר ו ל י ז ה ס פ ו נ ט נ י ת .
^
C
—NH
CH-
— — CO
> $
C
—
»
° \ /°
.
X
C
\ j
+
C =r
X
X
על
אלנין
ידי
מיד
ריאקציה
)מחוזר(.
מ ב ו ס ס י ם ה ח י ת ו כ י ם של קשרי
טריפטופן.
זו
ב כ ו ל ם ק י י ם בשרשרת ה צ ד ד י ת קשר
כפול^^ -
ת ג ו ב ה עם ת ר כ ב ו ת .ב ר ו מ י נ צ י ה כ ג ו ן
(; ) .)X= Br
הריאקציה
A
B
N
(
ברום,
טירוזין.
היסמידיז
היוצר מרכז
א ל ק ט ר ו פ י ל י על
- Nב ר ו מ ו -ס ו ק צ י נ א י מ י ד ) ( NBS
.
פ ו ת ח ה ל ר א ש ו נ ה ל ב ק ו ע קשרי ט ר י פ ט ו פ ן ).(34-36
ופניל-
וN -
-
-
תגובה
ז ו המוצאת לפועל ב -
פפטידיים
ניתן
4
ב נ י צ ו ל ו ת של 90%
היה לקבוע בשיטה
ה , ( T M V (37 -
זו
7
תוך ש נ י ו ת ס פ ו ר ו ח ,
pH
.50 -
-
ב ח ל ב ו נ י ם חלה
יושמה בהצלחה במודלים
י ר י ד ה ב נ י צ ו ל ת ההיתוך )50%
תומצות א פ י נ י ו ת הסמוכות ל ש י י ר י ט ר י פ ם ו פ ן
א ל ב ו מ י נ י םרום הבקר ) ( 3 7והאדם
),(38
ליזוזים
בגלוקגון
) (37 , 3 9
אחד מ י ת ר ו נ ו ת השיטה טמון באפשרות המעקב הםפקטרלי אחר מהלך הריאקציה,
בבליעה
האופינית לשייר האינדולי
אוכסאינדול-לקטון
בחלבונים
VI
.
על
ב280-
והעליה כmji 260-
rap.
ש נ ו י םפקטרלי
, ( 1 0אולם)(36
חלבון
והמוגלובין
).(64
הודות לירידה
המתלוית להופעת ה ס פ י ד ו -
זה מבוססת שיטה לטיהרציה של ש י י ר י
טריפטופן
).(36
מנגנון
הביקוע על קשיר
מירוזין
דומה,
)(40-42
כאמור ,לזה שהוצע לבקוע קשרי
טריפטופן:
VII
השיטה .הופעלה בהצלחה על מ ו ד ל י ם פ פ ט י ד י י ם
נקבעו חמשה מתוך ששת קשרי
מהחפצון
ב-
- S
ש י י ר י הציסטאין על
הטירוזין
ידי
).(43
NBS
)43קרבוכסימתיל-ריבונוקליאזה
1
ב נ י צ ו ל ו ת של 80%
הקשר
( לא נבקע.
(.
A
)אי
בין
.60 -
טירוזין
בדיבונוקליאזה,
וחומצה ציםטאית )המתקבלת
לעומת זאת נבקעו כל הקשרים
ביקועו
ל הקשר
H03r-C!yS־!fy
הטירוזיליים
בריבונוקליאזה
- 8 -
מחומצנת
-
הפפטידי
על
בחלבון;
על
קשרי
בקוע קשרי
ב נ י ג ו ד לביקועו
י ד י כך הופך החמצן
) ב נ ו ס ף לקשרי
הקרבונילי
ק י ו ם סטרוקטורה
ידי
ל נ ו ק ל י א ו פ י ל חלש
ט ר י פ ט ו פ י ל ( על
ידי
NBS
יותר(.
ה י ם ט י ד י ן מצריך תנאים אחרים.
טריפטופן
והיםטידין(
חלה רק לאחר הריסת עודף ה -
בשיטה
גם בטמפרטורת
אנלוגי
מנגנון
זו
נחתכו
הפעלת 3מול
NBS
גורמת לחמצון
החדר בתמיסת 50$חומצת חומץ
לזה של ח י ת ו ך קשרי
).(40
3-4
pH
ש י י ר ה ה י ס ט י ד י ן אך לא
ניחן
)בה
לבקיעתו.
).(45
ב נ י צ ו ל ו ת של 70$
) ב נ י צ ו ל ו ת של 25$
וטירוזין.
גם כאן
נקבעו
•VII
ב-
וחמום ל 1 0 0 ° -משך שעה
פפטידים של ה י ס ט י ד י ן
טריפטופן
NBS
נוחה לכך
ח ל ב ו ן אחר בו
הוא ה מ ו ג ל ו ב י ן
באופן ספקטרלי אחר הופעת ה ד י ב ר ו מ ו -ד י א נ ו ן -ס פ י ר ו ל ק ט ו ן
נבקעים כאמור קשרי
זו
)(44
י ד י החומצה הציםנזאית החזקה ,המתאפשרת על
טירוזיל
לעקוב
בפפטידים קטנים
-הוסבר כתוצאה של פ ר ו ט ו נ צ י ה על הקשר
,50החיתוךלפי
(20 -
י ו צ א לפועל
מ נ ג נ ו ן משוער
עבור הביקוע בטמפרטורה הגבוהה הוצע
המבוסס על חמצון הטבעת ה א י מ י ד ז ו ל י ת לחומצת קטו). ( V I I I )(46
R—NH—CH
'C — N H — R
ו!
'NHR
ו
0
2
— C
3 NBS
CH
2
pH 3 - 4
X
C0-C00H
NH
R—NH-CH
CH
v
)(VIII
C -= i!iHR
•R-NH-CH
• R - N H - CH — C O - N H R
I
CH
2
CH2
I
H O - C-
COOH
\
COOH
OH
HO
NH-CH-
'+ R
0
COOH
CH2
HO
_ R
- 9-
השימוש
בשיטה
בחלבונים
ב מ י ו ג ל ו ב י ן ס ל whule (45
הודגם
ובריבו נוקליאזה
( s p e r m
).(46
בקוע
קשרי
טטרהידרופנילית
NBS
פ נ י ל א ל נ י ן על י ד י
ליתיום
) ,(47ע ל י ד י
חיזור
מחייב
הטבעת
מ ו ק ד ם של
הפנילית
למערכת
ב - 7 0 ° -ע ד .-80°
במתיל-אמין
R
I
Li
MeNH2
NBS
2
הביקוע
הודגם בפפטידים
אי אפשר לבקע קשרי
אולם
+ R NH
היסטידין
1
)(65 - 75%
וקשרי
ו ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה ). ( 4 8 ) (5 - 10%
פ נ י ל א ל נ י ן מ ח ו ז ר מבלי לבקע קשרי
פותחו מספר שיטות המאפשרות להבדיל ב י ן
ביקוע ש י י ר י טריפטופן
השיטות פבוםסות על שימוש בריאגנטים מחמצנים בעלי
או על מ ו ד י פ י ק צ י ה של אחד משני
הן
N
בקשרי
ב ד ו מ ו -א ו ד י א ה )(49טידוזין.
נתרן
הפיכת ה ש י י ר ה א י נ ד ו ל י
על י ד י
NBS
ה ש י י ר י ם ,המונעת את ב י ק ו ע קשרו.
ו ת ר י ב ד ו פ ו -ק ד ם ו ל ) ( 5 0הפבקעים קשרי
פ ר י ו ד ט הוא מחפצן אחר המבקע קשרי
ל ס פ י ר ו -א ו ק ס י נ ד ו ל -ל ק ט ו ן ). ( V I )(51
אפשר למנוע על י ד י
ה פ נ ו ל י ת ) ( 4 5א ו על י ד י
-0אצטילציה או
0
-
מ ד ק ו ר י ז צ י ה עם כספיח אצטט ) . ( 5 2
הפחפצן של הקשר ה ט ר י פ ט ו פ י ל י על י ד י הפיכתו ל - N -פ ו ד מ י ל
ריאגנט
קושלנד
) - 2ה י ד ד ו כ ס י
- 5 -
וטידוזין,
טיריזין.
י ו ת ר פ ז ו של
NBS
תרכבות ברום סלקטיביות
טדיפטופן
טריפטופן
את
טריפטופן
ושיירי
ר י א ק ט י ב י ו ת גבוהה
כאמור,
גאופן
פבלי
לפגוע
ס ל ק ט י ב י ,תוך
ב י ק ו ע קשרי
הטירוזיל
ק ד ב ו ב נ ז ו ק ס י ל צ י ח של הקבוצה
מאידך
ניתן
למנוע את הביקוע
ק י נ ו ר נ י ן ) ( 5 3א ו ע ״ י הפעלת
נ י ט ד ו ב נ ז י ל ב ר ו מ י ד ( המגיב באופן
סלקטיבי עם ש י י ר י
-
ם ר י פ ט ו פ ן )(54
תוך
. ( N B S (56
כהן
על
ידי
שיטה ל ב ק ו ע
ליד האנודה
ניצולות
אלקטרופילי
ומגייר
ט י ר ו ז י ן על
, ( IX
ידי
חמצון
ח מ צ ו ן על
אלקטרוליטי
ידי
פ ו ת ח ה על
. NBS
והקשר ה - C -א מ י ד י
ידי
הטירוזין
ה ס מ ו ך נ ב ק ע אחר כך
. p H
ה ח י ת ו ך ב מ ו ד ל י ם פ פ ט י ד י י ם ה י ו ( 5 9 , 5 7 ) 30 - 50%
ובריבונוקליאזה
^
אמיני
()
של השרשרת ה צ ד ד י ת ,ה י א ז ו
. CNBr
בלתי
ציאנוגן
ציאנו-סולפוניום ) X
יציאת מ ת י ל ת י ו צ י א נ ט לאחר התקפת ה ק ר ב ו נ י ל ה א מ י ד י
לקטון ) ( XIק י צ ו נ י הדש.
- Cא מ י ד י עם מ ר כ ז
ה מ ב ק ע ת קשרי מ ת י ו נ י ן עם
כ א ן ה ק ב ו צ ה ה ע ו ז ב ת ה י א ה ג פ ר י ת ,ה נ מ צ א ת ב מ צ ג על
ת ג ו ב ת עם
-
ב י ק ו ע א ח ר ת ה מ ב ו ס ס ת ע ל א י נ ט ר א ק צ י ה 1-5של הקשר ה -
ה מ צ ו י בעמדת
ברומיד ).(61
אימינו
י ש י ר של ק ש ר י
ט ט ר ה -צ י ק ל י ו ת ) (55ש א י נ ן
נ ב ק ע ו ת יווזר על
ידי
)(60־
ריאקציה
לאחר
נגזרות אינדולין
להידרוכסי-דיאנון )
3
המום התמיסה ב -
5-30%
10
) . ( 5 7 - 5 8ה ר י א ק צ י ה ד ו מ ה ב מ ה ו ת ה ל ז ו של
ועוזריו
מהחמצן
יצירת
-
יציב העובר ה י ד ד ו ל י ז ה ס פ ו נ ט נ י ת להומוםרין
יוצרת
לקטון
(
- 11N H R
I,
N H R
H3-J-L^-OH,־•&־<
<
0
0 H 3 - S - C H 2 - C H 2
C N
) ( X
N H R
N H R
C
— C H
י
0
°
/
2
H
C H - N H R
C
C
I
0
°L
011
C H
• C H
2
^
s
^2
) ( X I
C H
ה ר י א ק צ י ה
י ו צ א ת
ה ש י ט ה
נ ו צ ל ה
ה ש י ט ה
ב י ו ל ו ג י ת
ה ב י ק ו ע
) ג (
ה)CH-אציל
Z=NH,3־(XJI
ע ל
ב ק ב י ע ת
כ ש ה פ ח מ ן
ב כ ל
ה מ ק ר י ם
ג ר ו ס
ה א ל ק ט ר ו פ י ל י
N-אמידי,
^
א
ה ק ש ר
צ
י
ה
ל
ב י ו ת ר
נ מ צ א
ש ל
ק ר ו ב
ג ל ו ב ו ל י נ י ם ,
ח ל ב ו נ י
ר ק מ ו ת
ש פ ו ת ח ה
T
ע ד
ה פ פ ט י ד י ם
ו פ פ ט י ד י ם
ו ה ו ר מ ו נ י ם .
.74-82$
מ א ז
).(63
ב ע ל י
ז ו ה י
פ ע י ל ו ת
ש י ט ת
כ ה .
ב ש ר ש ר ת
N-
נ י ת ן
ל ר א ש ו נ ה
ע ל
ה ם
ד י ב ו נ ו ק ל י א ז ה
ל ש ל ש י ם
י צ י ר ת
- N -א צ י ל י
ה ח ד ר ,
נ י צ ו ל ו ת
ה ח י ת ו ך
ח ל ב ו נ י ם
ב ע מ ד ה
ת י א ו ז ו ל י ד ו ן
ו
ו ה ו פ ע ל ה
)(62
ה ר א ש ו נ י ם
א נ ז י מ י ם ,
ה י ע י ל ה
ת ו ך
ב ט מ פ ר ט ו ר ת
ו ו י ט ק ו פ
מ ב נ י ה ם
ב י נ י ה ם
ה ל א -א נ ז י מ ת י
פ י ר ו ל י ד ו ן
)
י ד י
),(28
)Sאו
pH
^ 1
ל פ ו ע ל
ה ו צ ע ה
SCN+
3
ה צ ד ד י ת ,
(
ה ו א
,
(
ל ה י ד ר ו ל י ז ה
ק ל ה
)
ל ה י ת ק ף
?N־0=Z(,XII
)
2
ע ש ו י
c
.(—XII4XIH
ע ל
X,
f
י ד י
ח נ ק ן
-א צ י ל
(
.
-
1 2
— •CO- N H — C H — C O - N H
— CO - N
—CH- CO-NH
2
-
\ CH,
CH
)(xn
4
X
—T
H0
2
)(-COOH
—HN
— CH— CONH
<L0
S
)(XIII
X = C H , 0,
2
coa, CN
= Y
Z = 0, NH
ד ו ג מ א לפחמן א ל ק ט ר ו פ י ל י בעמדה
הגלוטמית.
טבעת
^
ו7דא
הפחמן ה -
^ -ק ר ו ב כ ס י ל י של ש י י ר החומצה
ב ע ק ב ו ת כ ל ו ר י נ צ י ה של הקבוצה ה - ^ -ק ר ב ו כ ם י ל י ת עם ת י ו נ י ל כ ל ו ר י ד נ ו צ ר ת
- Nאציל-פירולידונית.
הקשר ה - N -א צ י ל י נ י ת ק בתמיסת א ל ק ל י מהולה•.
1
CO—CH-CO—NHRי '' R
—R'—CO-NH—CH
— CO - N H
R'— CO—NH
S0C12
־ ׳ /
2
J
CH
•CH:
Cl— C
HO—C
//
0
0
"•CONHR
HN-
1
י R ' - C O - N — CH - CONHR
\
0 . 1 N
COOH׳+R
NaOH
0=0H2
/
0
הריאקציה ה ו ד ג מ ה ב ב ק ו ע מספר פ פ ט י ד י הומצה ג ל ו ט מ י ת ב נ י צ ו ל ו ת ט ו ב ו ת ,א ו ל ם היא מ ל ו ו ה
ב ר י א ק צ י ו ת ל ו א י ).(65
ןיל א י נ ט ר א ק צ י ה ד ו מ ה מבוססת שיטת ה ה י ת ו ך של פ פ ט י ד י ם ר י ז )(66
) ,(68 ,67שהוצעה על י ד י ק נ ק ו
הכלורוקרבונילי
וחבריו.
וחריאונין
כאן הפחמן ה א ל ק ט ר ו פ י ל י הוא הוא הפחמן
הנקשר לשרשרת הצדדית על י ד י הפעלת פ ו ם ג ן .
13
-
־
'RCO—NH-CH-COR
A
•R C O - N H - C H -COR
|
xylene
12
ג
C Q C
|
CHX
X
G
H
^ C I — C O - O
-COR
/
HO
HN-
'COR
OH
RCOOH
RCO- N
C
I
CHX
-X
0 ^ 0
CH-j
בהרתחח הנגזרת ה - 0 -כ ל ו ר ו ק ר ב ו נ י ל י ת בתםיםת קסילן חלה צ י ק ל י ז צ י ה ל -
אוקסזולידין
ניצולות
לשלבי
החיתוך של פ פ ט י ד י
הכלורוקרבונילציה
לכלורואלנין(
מרכז
הפעלת
יון
בעובר אח״כ ה י ד ר ו ל י ז ה אלקלית ע ד י נ ה ,תוך
ה צ י א נ י ד על ש י י ר י
איפינותיאזולידיני
הN -
סדין
והציקליזציה,
ע ל ו ל י ם לצמצם את
אלקטרופילי
ותריאונין
נ י ת ו ק הקשר ה -
היו .60-90$
וכן
- Nאציל
-Nפפטידי.
ברם ,הצורך בסביבה ע ל -פ י מ י ת
ק י ו ם ריאקציה ל ו א י במקרה של םי״יז
)דיקרבוכםילציה
י י ש ו ם השיטה ב ח ל ב ו נ י ם .
נוסף המגיב באופן דומה הוא הפחמן
ציסטין
;X =H
ב 8 (69 -
שאף הוא כאמור,
אינו
H
p
(
.
ה ת י ו צ י א נ ט י ה נ ו צ ר על
הציקליזציה
ידי
יוצרת שייר אציל-
י צ י ב ו ע ו ב ר ה י ד ר ו ל י ז ה ס פ ו נ ט נ י ת תוך
נ י ת ו ק הקשר
-אציל-ציסטיני.
R CONH-CH-CQNHR
1
ן
2
CH
I
N S C — S
2
R CQNH-CH-C0NHR2
1
CN
pH 8
2
CH
t
S
ו
I
s
2
OT
SH
I
CH,
4
+
״CGNH-CH-CQNHR״R
4
3
R C0NH-CH-CQNHR
3
14 -
HN-
״-CONHR
-
CH -CQNHR,־
R.,C0N
pH2
HN-C
R-jNH— CH — CCNHR2
CHo
y A
N =C—S
HN
+ R^OOH
ה ו א י ל והקשר ה ד י ם ו ל פ י ד י א י נ ו נ י ת ק ב א ו פ ן ס י מ ט ר י יש צ ו ר ך ב ח מ צ ו ן מחודש של
ה ק ב ו צ ו ת ה ס ו ל פ ה י ד ר י ל י ו ת ה נ ו צ ר ו ת ב ר י א ק צ י ה ,כ ד י ל ה פ ו ך את כ ל ש י י ר י הציסטאיץ ל ט ב ע ו ת
אימינו-תיאזוולידיניות.
בשיטה ז ו נ ת ת כ ו קשרי ה צ י ם ט י ן ב א ו ק ס י ט ו צ י ן
)(2
א י נ ט ר א ק צ י ו ת צ י ק ל י ו ת עם מרכז
)א(
כשהאסום ה נ ו ק ל י א ו פ י ל י נמצא בעמדה
ר ב ו נ י ל י של הקשר ה - N -א מ י ד י .
קשרי ם ר י ז
נ ו ק ל י א ו פ י ל י בשרשרת הצדדית
^ של השרשרת ה צ ד ד י ת ,ה ו א תוקף את הפחמן
על ר י א ק צ י ה ז ו מ ב ו ס ס השחלוף
ותריאונין.
ו ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה ).(70
א צ י ל י של ,
N-n-40
קשרים אלה מ ו ע ת ק י ם לחמצן ה 2 -ן -ה י ד ר ו כ ס י ל י על י ד י פ ע ו ל ת
תומצות חזקות.
C H - •CH-
\
H2N
0=C
R
•— CH
—CH
־0H
I
I
N
0
׳׳^C
N
־0H
/
OH
R
)(XIII
)(XV
CH-
+ H20
H
2°־
CH -
CH
A
N
R
)(XIV
ו.
.:0H
CH
—
/
<>
HN
־
15־
תוצר ה ב י נ י י ם המשוער ה ו א ה א ו ק ס ז ו ל י ן XIVאו
).(72 ,71
XIII
ההידרוכסי-אוקסזולין
ר י א ג נ ט י ם ה ג ו ר מ י ם לשחלוף ב ח ל ב ו נ י ם הם חומצה ג פ ר י ת נ י ת מ ר ו כ ז ת ),(74 ,73
חומצה ז ר ח ת י ת ) (75ו ח ו מ צ ה ה י ד ר ו פ ל ו ר י ת ).(77 ,76
מידת השחלוף של ש י י ר י פ ר י ן נ ע ה ב י ן
,60-90$ב ע ו ד שבשיירי ת ר י א ו נ י ן ה י א בדרך כ ל ל י ו ת ר נ מ ו כ ה ).(20-40$
פ פ ט י ד י ) ( XVנ י ת ן לבקע על י ד י ה י ד ד ו ל י ז ה ח ו מ צ י ת ב1101-
יותר מהירה.
6
את הקשר ה 0 -
, Nאו בהידרוליזה אלקלית
במקרה של ה י ד ר ו ל י ז ה א ל ק ל י ת יש ל מ נ ו ע את השחלוף ה ה פ ו ך ) 0
י ד י חסימת ה ק ב ו צ ו ת ה א מ י נ י ו ת החדשות ע ״ י א צ ט י ל צ י ה ) (74או
ד א מ י נ צ י ה עםH N(78
. ( 0
2
-
^ ( Nעל
ד י נ י ט ר ו פ נ י ל צ י ה ) ,(75א ו ע״י
השימה נ ו צ ל ה ל ב ק ו ע פ י ב ר ו א י ן המשי ),(74
)ליזוזים
,(74
א י נ ס ו ל י ן ) (77ו ח ל ב ו נ י ם אחרים ).(78
)ב(
כאשר המרכז ה נ ו ק ל י א ו פ י ל י נמצא בעמדת
ה ק ר ב ו נ י ל י של הקשר ה - C -א מ י ד י *
של ש י י ר ה ו מ ו ס ר י ן .
מרכז
§
בשרשרת הצדדית ה ר י ה ו ת ו ק ף את הפחמן
נ ו ק ל י א ו פ י ל י כ ז ה ה ו א הקבוצה ה - ^ -ה י ד ר ו כ ס י ל י ת
ש י י ר י ה ו מ ו ם ר י ן נ ד י ר י ם אמנם ב ח ל ב ו נ י ם ,אך ב א ח ר ו נ ה הוצעה ד ר ך ל ה פ ו ך
ש י י ר י חומצה אםפרטית ל ש י י ר י ה ו מ ו ם ר י ן ) (33 ,79על י ד י א ס ט ד י פ י ק צ י ה של הקבוצה ה jj -
LiBHקרבוכסילית ,מ ל ו ו ה ב ח י ז ו ר עם
4
י RCQNH — CH — CONHR
2
1
'RC0NH— CH—C0NHR
I
CHo
* I
C00H
R' '0H
H+
cl
I
יC00R
OH
־H
'RCQNH— C H — CONHR
I
ck
I
?
2
'RCONH—CH—C — NHR
CH 0H
2
)(XVI
CH —OH
2
RCONH- CH+H2NR-
'
0
2
CH
-
-H+
RCQNH— CH
C — NHR
־*־H
0
X
2
CH
-
שרשרת ר י א ק צ י ו ת דומה
ויצירת^-לקטון.
).(79
p
י כ ו ל ה לחול ב ש י י ר י חומצה גלוסמית תוך
השיטה הודגמה בפפטידים
בפפסין נקבע בדרך
-ברומו
16
-פנאציל
-
ז ו קשר אחד של ש י י ר חומצה אםפרטית שאוסטרה תחילה עם ה א י נ ה י ב י ט ו ר
-ברומיד,
הקבוצה
נוקליאופילית ) XVI
ההידרוכםילית
והוזרה לשייר הומוםרין
גרוס
(.
הפפטידי
בונים על
ל פ י ו ה פ ר ו ט ו נ צ י ה הלה על
נ ו ק ל י א ו פ י ל י ת את הפחמן
ה ה י ד ר ו ל י ז ה החומצית של
הסמוך.
אספדםיח
י כ ו ל ה לגרום לקטליזה
על כך מבוססת שיטת שולץ ) (83 , 8 4
ה י ד ד ו ל י ז ה חומצית )
^
אולם
.
-הידרוכסי-בוטיראמידים
HC
10.03105°,
N
נ ו ק ל י א ו פ י ל י ת של שבירת הקשר
ל ב י ק ו ע מבוכר של קשרי חומצת אםפרטית
.
(
בשיטה
זו
נבקעים קשרי חומצה
ו א ס פ ר ג י ן במהירות גדולה פי מאה מ ז ו של קשרים פ פ ט י ד י י ם אחדים.
מראים שהאספרגין עובד ה י ד ר ו ל י ז ח לחומצה אספרטית ל פ נ י החיתוך
הציע
נוח
(80המתאימים ל מ נ ג נ ו ן שהובא ל ע י ל .
הקבוצה ה - p -ק ר ב ו כ ס י ל י ת עצמה
ידי
).(81
) (80מציע מ נ ג נ ו ן אחר,
מנגנון
תפקיד הקטליזה החופצית
ה ק ר ב ו נ י ל ה א מ י ד י ,ההופכת אותו למרכז
ו ה ק ר ב ו נ י ל האמידי הוא התוקף
הצעתו סותרת את ממצאיהם של מחקרי
),82
ציקליזציוז
ב נ י צ ו ל ו ת של כ 40%-והופעלה גם על ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה
בריאקציה הביקוע הוא לגרום ל פ ר ו ט ו נ צ י ה של חמצן
להתקפה
1 - 6
),83
ממצאים ק י נ ט י י מ
.(85
ו י ט ק ו פ )(26
מ נ ג נ ו ן ריאקציה הכולל תוצר
ב י נ י י ם ב י צ י ק ל י מסוג האורתו-אםטר-אמיד על מנת להסביר
את נ י ת ו ק הקשרים ה פ פ ט י ד י י ם משני
מתירות השחרור של חומצה
צידי
ש י י ר החומצה האםפרטית.
אספדטית ת ל ו י ה במיקומה בשרשרת חפפטידיח ,כפי שהוברר מחקירת ה ב י ק ו ע של ח ל ב ו נ י ם כ ג ו ן
אינסולין,
חלבון
ריבונוקליאזה
וגלוקוגון
ופפטידים
ה. ( T M V(85-
שיטה להיתוך קשרים
בקטליזה
),(83
ליזוזים
וציטוכרום
(84
, ( C
של
C
-פ פ ט י ד י י ם של ש י י ר י
תריאונין
נ ו ק ל י א ו פ י ל י ת א י נ ט ר א מ ו ל ק ו ל ד י ת הוצעה לאחרונה על
השיטה מבוססת על חמצון מוקדם של ש י י ר י
התריאונין
והסדין
דיציקלוהקסיל-קרבו-דיאימיד
)(DCC
וחומצה
ידי
ו ס ר י ז היוצאת אף
דאנג׳לי
לשיירים
וחבריו
לפועל
),86
.(87
ק ט ו -א מ י ד י י ם או) ( 0DMS
זרתתית
).(88
י
׳
דו
N H -
— C O
—
C
H
—
— N H
—
- C O
D C C
I
C R
4
C O - N H
C H -
D M S O ,
N H -
C O -
I
C H R
H P0
I
3
O H
3
ב ע ק ב ו ת
ז א ת
פ נ י ל -ה י ד ר ז י ן
)1XVII
ג ו ר מ ת
(
מ ו כ נ ס
א ו
ל נ י ת ו ק
ה נ ו ק ל י א ו פ י ל י
ה מ ר כ ז
ה י ד ר ו כ ם י ל א מ י ן .
ה ק ש ר
C
ה -
א
מ
י
ד
צ י ק ל י ז צ י ה
י
-
ה צ ד ד י ת
ל ש ר ש ר ת
ל נ ג ז ר ת
C H
ע ל
H ,
י ד י
פ י ר ז ו ל ו ן
R
=
י צ י ר ת
) X V I I
(
ב ס י ס י
א ו
ש י ף
ע ם
א י ז ו -א ו ק ס ז ו ל י ן
.
" C O N H R
— C H
R ' C O N H
R L O
O
— N H R
C
— C H
^
— ' R
/
ז /
׳ "CO-Affi
—
H
NHPh
O H
C
— R ' C O N H
N-
R C
N
C H — C O
2
R " N H
+
ץ
C O
— R ' C O N H
/
R"NH2
+
— R ' C O N H — C H
/
^Ph
R C
)(XVII
)(XVTII
^ C H
H ,
= R
-
ב ח י ת ו ך
ה ב י ק ו ע .
ה י ד ר ז י ן
) ג (
ש ל
פ פ ט י ד י
ב פ פ ט י ד י
א ל א
מ ר כ ז
ה ק ש ר
ר ק
ת ר י א ו נ י ן
ס ד י ן
ע ם
ה -
C
ה ו ש ג ו
נ י צ ו ל ו ת
ש ל ב
ה י ד ר ו כ ם י ל -א מ י ן ,
ו ג ם
נ ו ק ל י א ו פ י ל י
-א מ י ד י
ה י ו
1 8
ה נ מ צ א
£
ב ע מ ד ת
) א י נ ט ר א ק צ י ה
-
ש ל
נ י צ ו ל ו ת
ה ח י מ צ ו ן
ז א ת
8 0 - 9 0 $
5 0 - 6 0 $־
ב י ת ר
ב ש ר ש ר ת
ב ש ל ב
א ט י ו ת
ה צ ד ד י ת
ה ב י ק ו ע
מ א ש ר
ת ו ק ף
ב ב ק ו ע
א ף
ה ו א
^
יי
— N W — r n
י צ א
ק ש ר י
א ת
>
-
H
+
V
j
N
n
_
r
ה פ ח מ ן
C
ך
0
0
) ( Try, His
א ח ר ת
) , 8 9
י ו צ ר
ה י א
ד ר ך
. ( 9 0
א ח ד
ה ח י ת ו ך
ה ש י ט ה
כ ך
ל ע י ל
ה ח ד ש ה
מ ב ו ס ס ת
j
f
1
) ( Glu
ד ו ג מ א
_ wwח ו >
_
״ C H
2
ד׳
ל כ ך
_
,
I' 1
׳׳
C H 2
ה ו ז כ ר ה
ה ק ר ב ו נ י ל י
S
—N H
L
2C
ע ם
ת ר י א ו נ י ן .
C H
m
0
ל פ ו ע ל
פ נ י ל -
. ( 1 - 6
0
4.
ה ו ז י פ צ ו ן
ל א
ו 5 0 - 9 0 $ -
ב ש ל ב
ע ל
ש ל
) ע מ י
ק ש ר י
ה כ נ ס ת
ט ט ר ה י ד ר ו פ י ר י ד ז ו ן
( 1 6
)
ב ב י ק ו ע
מ ר י פ ט ו פ ן
ק ב ו צ ת
X X I
(
ע ל
ו ה י ם מ י ד י ז
-ק ט ו
י ד י
ק ש ר י
ח ו מ צ ה
.ל ש ר ש ר ת
צ י ק ל י ז צ י ה
, T=N
ג ל ו ט מ י ת
ש ה ו צ ע ה
ע ל
ה צ ד ד י ת .
ע ם
=T
X = CH,
מ ת ו ז ד ת .
י ד י
ד ו ג מ א
מ ו ר י ש י ט ה
ה ש י י ר
ה י ד ר ז י ן :
X =N
ו ח ב ר י ו
ה א ו ק ס ו -א צ י ל י
-
-
19
•RNH—CH—CONHR
2
'RNH—CH—CONHR
CH
CH.
I
K
C-0
1
N
'CH NHR
2
HN.
H NNH
2
2
)(XIX
R N H — CH
CO
\
NH
/
/
'RNH — CH -CONHR
N
=
RNH — C H — CONHR
I
"'R
״CH
)(XXI
C — 0
NHCHO
-J
H2NR
במקרה של ה י ם ט י ד י ן מוכנסת קבוצת
מלווה
^
ב ה י ד ר ו ל י ז ה תומצית מתונה ה י ו צ ר ת ש י י ר
של ט ר י פ ט ו פ ן מושג הדבר על
י ד י חמצון
).(92
מ ו ד ל י ם של פפטידים
הריפים
יתסית )הרתהה עם ה י ד ר ז י ן
בניצולות
ץ -אוקסו-אורניתין )
לשייר
- Xא ו ק ם ו -א צ י ל י י ם נבקעו
חלקי של קשרי חומצה אםפרטית.
כ ו ל ל ו ת של 35-70%
אוזוני
-ק ט ו על
ב-
ידי
ר י א צ י ת גמגרגר )(91
pHי 3 , 6למשך
- Nפורמיל-קינורנין )
באופן כמותי
XX
(
) (90אם כ י בתנאים
1-2שעות( העלולים לגרום ל ב י ק ו ע
שיטת הביקוע הופעלה על מספד פפטידי
) 55-95%על בסיס
.(XIX
במקהה
הקיגורנין(.
טריפטופן
)(90
-
.2
N
בקוע קשרים
בסיסים
כדוגמת קשרי
20
-
-א מ י ד י ם ש ל י ש ו נ י י ם על
נוקליאופיליים
-Nאציל
כגון
י ד י התקפה
י ו נ י הידריד
גימולוקולריוז
ו ה י ד ר ז י ד מבקעים קשרים אמידים ש ל י ש ו נ י י ם
פרולין.
r
־0
I
HN
c
N
-> —c
-C0-N
V
CON©
—CONH
C0NH-
2
קשרים
פפטידיים
ש נ י ו נ י י ם א י נ ם נבקעים כ י
נוספת מצד ה נ ו ק ל י א ו פ י ל הטעון
ב נ י צ ו ל ו ת עד 90$בעזרת ל י ת י ו ם
כפו
כן בקעו את הקשר
גרפיצידין
בםפיםים
S
שלילית.רוםנברג
וטירוצידן
ו. C -
ה א ל פ י פ י י ם הדרושים לחיתוך
תרפינליות
ו ש י י ר י אספרגין
והידרוכםיפרולין
וגלוטפין.
הקשר ה פ ר ו ל י נ י
בהידרוליזה
במים.
בעזרת נתרן
ה י ד ר ז י ד ב ה י ד ר ז י ן אלמימי
לרבות
גרמיצידין8
וולין
אצטאמיד כדי
פגבלות השיטה הן
קאופפן
פפטידי
).(96
נעו
קרבוכםיליות
^אציל
ה י ד ר ז י ד באתר ב , 0 ° -
ושריד
)(97
נ י צ ו ל ו ת החיתוך של פפטידי
בין .50-90$
).(47
שניוניים.
פרולין
פלווה
נבקע על ידם ב נ י צ ו ל ת של 70$
פצ׳ורניק,וילצ׳יק
פנילאלנין
ח י ז ו ר קשרים פפטידים
ח י ז ו ר קבוצות
וסןבל ) (95בקעו קשרי
ב.-70°-
אלמימי,
ב.25°-
קשיי פסיסות של פפטידים
כגון
י ד י הפעלת נתרן
-היפרטנםין
כאמור גם הטבעות ה ב נ ז נ י ו ת של ש י י ר י
למנוע
ע-פרולין
ה י ת י ד אשר ב א י נ ס ו ל י ן
במתילאמין
5 -
בקעו
פרולין
בפפטידים ה צ י ק ל י י ם ה א נ ט י ב י ו ט י י ם
ודיאקציות-לואי
ב נ י צ ו ל ו ת גבוהות על
החיתוך בעזרת ל י ת י ו ם מומס
וחבריו
) (94 , 9 3
H
ה נ ו צ ר מתנגד להתקפה
א ל ו מ י נ י ו ם ה י ד ר י ד בתפיסת ט ט ר ה י ד ר ו פ ו ר ן
ס-פנילאלניל-
B
א נ י ו ן האמידו
X = H " ,־NHH
בתנאים אלה
המערכת כללה גם
ב י צ ע ו את
פרולין,
נחזרים
^מתיל-
בעקבות ע ב ו ח ת י ו של ב י ר ץ ׳ ) (98על ת י ז ו ר א מ י ד י ם ש ל י ש ו נ י י ם ה צ י ע ו ו י ל צ ׳ י ק ו ח ב ר י ו
) (99לבקע קשרי - Nא צ י ל פ ר ו ל י ן בעזורת נ ת ר ן מומס ב א מ ו נ י ה נ ו ז ל י ת ו ב נ ו כ ת ו ת כהל בחומצה
השייר ה - N -א צ י ל י נ ת ז ר ל נ ג ז ר ת א ל ד ה י ד י ת או כ ה ל י ת .
פרוטונית.
" /
Na/NVCH OH
R C H 0
3
4־
HN
r
־/
RCO — N
-33°
V
RCHgOH
*
•CONHR
'CONHR
בשיטה ז ו נ י צ ו ל ו ת ה ח י ת ו ך ג ב ו ה ו ת י ו ת ר ) (70-100%ו כ ן מצטמצמות בהרבה ר י א ק צ י ו ת
לואי
כ ג ו ן ב י ק ו ע ב ל ת י -ם פ צ י פ י של קשרים פ פ ט י ד י י ם אהרים ו ת י ז ו ר ת ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת א ר ו מ ט י ו ת .
השיטה ה ו ד ג מ ה ב י ן השאר ב ב י ק ו ע פ פ ט י ד י ם צ י ק ל י י ם ) י ל י ן - 5 -ה י פ ר ט נ ס י ן ו ג ר מ י צ י ד י ן ( S
ו ב ב ק ו ע הקשר ת ר י א ו נ י ל -פ ר ו ל י ן ב א י נ ס ו ל י ן ).(99) (80-100%
ז ו ב פ ו ל י פ ר ו ל י ן ,ב א ו ב ל ב ו מ י ן ),(99
פ ר ו ל י ן - Cת ר פ י נ ל י נבקע בשיטה
ו ו י פ ר ט ו ק ם י ן ) .(100כ מ ו כ ן ה ו פ ע ל ה השיטה ב ב י ק ו ע
קשרים פ פ ט י ד י י ם ש ל י ש ו נ י י ם אחרים כ ג ו ן קשרי ה י ד ר ו כ ס י -פ ר ו ל י ן ו ס ר ק ו ז י ן ).(99
ה מ נ ג נ ו ן שהוצע ) (41ל ר י א ק צ י ה ה ב י ק ו ע כ ו ל ל ש נ י שלבים של ח י ז ו ר ח ד -א ל ק ט ר ו נ י של
ה ק ר ב ו נ י ל ה - N -א מ י ד י ,מ ל ו ו ה ב ה י ז ו ר דומה של תוצר ה ב י נ י י ם ה א ל ד ה י ד י .
- H
0
HN
\CONH-
f
11
R— C - N
R— C
I
H
־2e
(0
0
7SC
RCILjOH
*•2e~(NH3)xNa
C-N
+
)2H (R0H
CONH-
r
CONH-
\
- 22 -
קשרי
- Nאציל-פרולין באינסולין Bובאפו-פדדוקםין נבקעו גם על ידי בניסק וחבריו
ייתכן ומקור הפרוטונים אצלם
) (102 ,101על ידי נתרן באמוניה אנהידרית ,אך בהעדר כהל.
הוא בפפטיד עצמו )קבוצות -COOH, CONH -וכדי( או באמוניום אצטט המשמש להפסקת הריאקציה.
.3בקוע השרשרת הפפטידית בפחמן >* -של שייר החומצה האמינית
א מ ה
י ו צ ד ת שיירי
׳
1
RCONH—C-CONHR
דהידרואלנין,
בסיס
ו
משיירי ציסטאין
•RCONH— CH—CONHR
^ ( x r ) 2־
ס
ד
י
ן
•RCONH — CH — CONHR
?CH
I
xr
, S(CH )CN
3
3)2
C H
^
״
2
N 0
/T
, 0S0 Ar
2
לצורך
v
2
)0E0(0R
= Ser : X = 0 • XT
ריאקציה ה- y3 -אלימינציה יש לקשור תחילה לקבוצה הםולפהידרילית או ההידרכוסילית
קבוצות מושכות אלקטרונים ) ( Tהמשמשות כקבוצות עוזבות בעת האלימינציה.
דוגמאות
לקבוצות האלה הן קבוצות ה- S -דיניטרופניל ) ,(103דימתיל-םולפוניום ) (103וציאנו-מתיל-
םולפוניום בשיירי ציםטאין ,וקבוצות
- 0פוספוריל ) (105 ,104ו- 0 -אריל-םולפוניל
) (106 ,105בשיירי סרין.
שיירי הדהידרואלנין ניתנים לביקוע הידרוליטי או לביקוע מתםצן תוך יצירת פפטיד
אמיד מהד ,ופירוביל פפטיד או הידרוכסי-פירוביל פפטיד מאידך:
,
23-־
•COCONHR
•C — CONHR
+
RCONH -
n
CH2
OH
על ה ד י א ק צ י ו ת הללו מבוססת שיטת
שרשרות
חם השתמשו
מפטידיות ל י ד ־ ש י י ר י
בעיקר בקבוצת
בהפיכת
לקגוצח
4,2
שיירי
ח ת י א ו ל י ח על
-
ציסטאין
י ד י הפעלת
ת י ו פ נ ו ל ט יוצאת לפועל בתפיסת
הדחידרואלנין
פרפורפית
S
לשיירי
מהקטע ה C -פ פ ט י ד י
קבוצה
דיניטרומלורו-בנזן
N
נבקעו על
ג-
+ H NR
2
H
6-5
י ד י הרתחה ב -
ZCH C00H + C 0
2
p
.
2
pH
או על
החדרשיירי
י ד י הפעלת חומצה
ה - N -ה י ד ר ו כ ס י -פ י ד ו ב י ל י ת נותקה
י ד י הפעלת מי חמצן
^
H202
NaOH
אלקליים.
ZCH C0C0HNR
2
0H
בשיטה ארבע-שלבית
שני
קשרי הציםטאין
זו
נבקעו
באוקסיטוצין
) ב נ י צ ו ל ת של ( 4 0 - 6 0 $מספר פפטידי
).(103
בהפעלת השיטה על
מחוך שמונת ה ש י י ר י ם ה צ פ ו י י ם על חומצות א מ י נ י ו ת
ובמוחי
א ל י מ י נ צ י ה כמותית
בטמפרטורת
הקבוצה ה - N -פ י ר ו ב י ל י ת או
2
זו
לצורך ד י א ק ג י ת ה א ל י מ י נ צ י ה
נקשרת באופן סלקטיבי
.
) ב נ י צ ו ל ת של ( 5 0 - 6 0 $על
ל ב י ק ו ע סלקטיבי של
.(103
דחידדואלנין.
NaOH0.1
.
),107
וסוקולובסקי
-ד י נ י ט ד ו פ נ י ל ) ( SDNP
- 4,2
ה נ ו צ ר י ם עקב זאת,
ב0-
ציססאין
פצ׳ודניק
Z = H,
Z = H,
צ י ם ט א י נ י לרבות
ריבונוקליאזה,
נתגלו שבעה
ק י צ ו נ י ו ת הסמוכות לציסטאין
).(108
- 24 -
פפטידי
העוזבות
),105
סרין
יכולים,
כאמיר ,אף הם להיבקע דיר
ש נ ו ס ו עד כה לצורך ^ -א ל י מ י נ צ י ה הן
.(106
בהפעלת NaOH
-טוזיל-םרין
נתקבלו
0 . 1 Nאו
- 0מוזיל
יצירת ש י י ר י
(105
),104
ד י א ת י ל -א מ י ן על ד י פ פ ט י ד י ם של
- 0דיפניל-פוספוריל
- 0דיפניל-פוספוריל-סרין
או
0
או
מהמצנת ,מ ל ו ו ה בהפעלת מי המצן אלקליים ,הביאה לשהרור החומצה האמינית ה - N -ט ר מ י נ ל י ת
ב נ י צ ו ל ת של כ.50%-
הפעיל
הסדין
ה נ ג ז ר ו ת הדהידרואלניניות באופן
הפיכת ם ר י ן
- 0טוזילציה
"אנהידרו-כימוטריפםין"
ל ד ה י ד ר ו א ל נ י ן נעשתה גם
הםר-פעילוה,
ב י ק ו ע ן בדרך ה י ד ר ו ל י ט י ת
בכימוטריפםין
סלקטיבית מ ל ו ו ה ב א ל י מ י נ צ י ה על
ובכך הודגמה
כמותי.
דהידרואלנין.
ו-
הקבוצות
),109
, ( 1 1 0שבו עבר
י ד י הפעלת א ל ק ל י .
ה י ו נ י ו ת ש י י ר הסרין
י ד י כך
על
נוצר
ל פ ע י ל ו ת הקטליטית של
האנזים.
קבוצה
בכמה
פוספו-פרוטאינים.
הקבוצות
הפחמן
עוזבת
פ ו ט נ צ י א ל י ת אתרת לצורך א ל י מ י נ צ י ה
ה פ ו ס פ ו ר י ל י ו ת המותמרות,
> -־,1
וםוקולובםקי
מתאימה למספר ש י י ר י
הדהידרואלנין
הנוצרים.
פפטידיים.
א י ז ו ט ו פ זה
גם ב ק ז א י ן חלה
).(111
בוהק
< - pא ל י מ י נ צ י ה של פוספט מ פ ו ס ו י ט י ן ,
פםוידו-ראשון,
וקצ׳לסקי
פפםין
ידי
י צ י ר ת צמדי
נתקבלו
לפדות שהריאקציה
) (117חקרו
לאהדונה את
ופולי-פוספו-סרין.
י ו נ י ם עם
כנראה ,על ה א ל י מ י נ צ י ה של הקבוצה ה פ ו ס פ ו ד י ל י ת .
פ׳צורניק
- ^3א ל י מ י נ צ י ה בשעת
ומתוך תלות הקבוע ה ק י נ ט י בעצמה
השלילי של קבוצת הפוםפט ממוסך על
אפקט זה מקל,
בבקוע מחמצן של
של
פוסויטין
הדהידרו-פוםויטין
1
הריאקציה היא מסדר
מהמטען
פוספט מ פ ו ס פ ו -פ ר ו ט א י נ י ם בהפעלת א ל ק ל י .
האלקלית ,שכן הפוספט ה א י -א ו ר ג נ י שהשתחרר לא הכיל ** 0
נעשתה עם אלקלי בפים שהכילו
הקינטיקה של ה -
אניוני
ש ל י ל י על
י ו נ י ז צ י ת המימן
כי כמות הפוספט ה א י -א ו ר ג נ י המשתחרר בהפעלה אלקלי על
באמצעות מ פ ו י פפטידי כעשרה מקטעים
הדיפוספורילציה
-מושכת אלקטרונים פחות מאשר
ומטענה אף עלול להשפיע באופן
ח ל ה -א ל י מ י נ צ י ה של
) (105הראו
ז ו ,היא קבוצת ה -
על אף שקבוצת הפוםפט-הטעונה שלילית
- 0פוספט המצויה
הם מצאו
ה י ו נ י ת הסיקו
ק ט י ו נ י הנתרן
כי
כ י חלק
שבמדיים.
-
ס ו ג אחר של
ריאקציה
0
-
25
נ ג ז ר ו ת ס ד י ן טבעיות ה י כ ו ל ו ת להפוך
ל| -א ל י מ י נ צ י ה הם
הוכח כי
הגליקו-פרוטאינים.
ג ל י ק ו ז י ד י עם קבוצות ה ה י ד ר ו כ ם י ל של ש י י ר י
ה ו פ כ י ם בהפעלת אלקלי
בקוע
.III
-
לשיירי
ש י י ר י ם אלה ע ש ו י
לסייע
דהידרואלנין
םרין
וחומצה cC
ל נ ג ז ר ו ת ד ה י ד ר ו א ל נ י ן על
ה ש י י ר הסוכרי
וחריאונין
ידי
קשור לחלבון בקשר
ש י י ר י ם אלה
).(112
).(116-113
-א מ י נ ו -ק ר ו ט ו נ י ת ,בהתאמה
ב ז י ה ו י מקומות הקישור של ה ש י י ר י ם ה פ ח מ י מ נ י י ם ל ח ל ב ו ן .
ממרת העבודה
לשייר
ה ת י א ו ל י ת של
הציסטאין תפקיד תשוב בשמירת המבנה
שיירי
הציסטאין מהווה חלק של המרכז הפעיל של א נ ז י מ י ם
מ י ו ז י ן י ״ ,ז -ד ה י ד ר ו ג נ ז ו ת שונדת
מתכתיים
והפעילות ה ב י ו ל ו ג י ת של
ו׳ןוי
)(119,118
ב א נ ז י מ י ם אחרים ) . ( 1 3 0 - 1גשרי
כמו
.
הדיםולפיד
כן משמשת
ב י ן שני
היא כאתר
שיירי
מתן
א י נ פ ו ר מ צ י ה רבת-ערך על הקשר
ובקוע
סלקטיבי של ש י י ר י
הומולוגיים
לא
ח צ י -צ י ם ט י ן הם לעתים
הרבה
ציםטאין לאפשר השואה נוחה
י ד ו ע על א נ ז י ם המסוגל לבקע באופן
נגזרות
גדולה מאשר קשרי
סוקולובסקי
S
ע ש ו י ו ת שיטות ל מ ו ד י פ י ק צ י ה
ציםטאין.
),120
ט ר י פ ם י ן מבקע גם קשרי
.(121
ליזין
פותהה אמנם שיטה
אולם שיטת בקוע
וזנדגינין,
של ש י י ר י
ציסטאין.
מטרת מבודה
ולהפעילה
בחתוך קשרי
ציסמאין של
בנוכחות ש י י ר י
שרשרות פ פ ט י ד י ו ת ל י ד ש י י ר י
),103
שיטה
.(107
).(129
ז ו מאפשרת את בקוע הקשר
ציסטין.
צ י ם ט א י ן ,על
ציםטאין,
ה0-
ז ו היתה לפתח ולשכלל את שלביה ה ש ו נ י ם של שיטה
חלבונים.
זו
ואף במהירות
ו פ י צ ו ר נ י ק הציעו שיטה לבקוע ס פ י צ י פ י ל א -א נ ז י מ ת י של ש י י ר י
דרך הפיכתם ל ש י י ר י
ציסטאין
ספיציפיקשרי
-8אמינואתיל-ציסטאין
דהידדואלנין
של ש י י ר י
).(119
ב י ן המבנים הראשונים של ת ל ב ו נ י ם
-אמינואתיל-ציסטאין
ס פ י צ י פ י ת ל נ ג ז ר ו ת צ י ס ט א י ן ,שכן
יותר
מלבד
ב א ז ו ר הסמוך ל ש י י ר הציסטאין הנבדק.
המאפשרת בקוע טריפטי של
אינה
ב י ן מבנה
פפאין,
ק י ש ו ר לקופקטורים
קרובות בעלי השיבות מרובה בשמירת ה ק ו נ פ ו ר מ צ י ה הפעילה של מולקולת החלבון
ופעילות באנזימים,
חלבונים.
וחלבונים כגון
הקבוצה
פפטיךי
י
זו,
דגש מ י ו ה ד הושם על מציאת דרך לבקוע סלקטיבי
מטרה נוספת היתה למצוא דרך אלטרנטיבית לבקוע
ידי
באמצעות אינטראקציה אלקטרופילית של החנקן
ה-
בקוע הקשר ה -
ל א צ י ל י עם
^ פ פ ט י ד י של ה ש י י ר ה צ י ס ט א י נ י ,
נגזרת
S
-ק ר ב ו נ י ל י ת של ה צ י ם ט א י ן .
- 26 -
ב'
פרק
ב ק ו ע שרשרות פ פ ט י ד י ו ת ל י ד ש י י ר י
ע״י הפיכתן לשיירי
השיטה ש ב ו צ ע ה ע ל ידי פציורניק
מביםםת על ארבעה שלבים:
ציםטאין
דהידרואלנין
צ י ס ט א י נ י ל )(103 ,107
ו ם ו ק ו ל ו ב ס ק י לבקוע קשרי
) ( 1ה פ י כ ת ה צ י ם ט א י ן ל נ ג ז ר ה ו ה - S - 4 , 2 -ד י נ י ט ר ו פ נ י ל י ת )..( SDNF
) ( 2י צ י ר ת ש י י ר ד ה י ד ר ו א ל נ י ן ע״י
-3jא ל י מ י נ צ י ה ש ל
ד י נ י ט ר ו ת י ו פ נ ו ל בתפיסות אלקליות מהולות.
) ( 3ב ק ו ע ה י ד ר ו ל י ט י א ו מהמצן ש ל ש י י ר ה ד ה י ד ר א ל נ י ן ל פ פ ט י ד אמיד ו ל -זן -פ י ר ו ב י ל א ו
פפטיד ,בהתאמה ( 4 ) .ה ו ר ד ת ה ק ב ו צ ה ה פ י ר ו ב י ל י ת א ו
הידדוכםי-פירוביל
ע ל י ד י ה פ ע ל ת מ י חמצן
מחקרנו
.1
בשימה ז ו התרכז ב ע י ק ר ב נ ק ו ד ו ת ה ב א ו ת :
בחידון
ע ל מסמר
חום
לדהידרואלנין
הפעלת שיטח ה ח י ת ו ך ב ב ק ו ע ח ל ב ו נ י ם ש ו נ י ם .
tnro»j^yjy_ nft*pn-_• .1
5
ציסטאין
בנוכתות שיירי
ציסטין.
פ י ת ו ח שיטה משופרת ל ב ק ו ע ק ב ו צ ו ת - Nפ י ר ו ב י ל .
,III
-
ההידרוכסיפידובילית
א ל ק ל י י ם ,ת ו ך תשיפת ה ו מ צ ה אמינית ק י צ ו נ י ת חדשה.
ח ק ר ב ע י ת ה ה פ י כ ה ה ס ל ק ט י ב י ה של ש י י ר י
,II
-N
6
אינן
ק ב ו צ ת ה SDNP -
יתרונות!
p
H
לשיירי,דזז^דר^לןין
כקבוצה ע ו ז ב ת בחגוכוז ה א ל י מ י נ א י ח ג ג ג ז ד ו ו ז צ י ס ט א י ן ,חחבספח
קבוצות
פ ו נ ק צ י ו נ ל י ו ת א ח ר ו ת ב ג ו ן א מ י נ ו או
מ ג י ב ו ת כלל בחנאיס אלה.
) f״
חסרון
פנגזדות
ב מ י ד ה שהן
וכמותית בטמפרטורת חחדד,
חידדופסי
מ ג י ב ו ת לאט או
תגובת חאלימיזציח כ נ ג ז ר ו ת 8־ ד י נ י ט ד ו -פ נ י ל -ציסטאין
היא כ מ ו ת י ת ו נ י ת נ ת למעקב ס פ ק ט ד ו פ ו ט ו פ ד י
4 0 8
בנוכחות
ד י נ י ט ר ו פ נ י ל צ י ח של ה ק ב ו צ ה ח ת י א ו ל י ח ח י א מ ח י ר ח
.
• X max
שייךי ,צי0מיז
ו ק ב י ע ת כ מ ו ת י ת של י ו ן
ח ד י נ י ט ד ו פ נ ו ל ט המשחחדד
(•
ש י ט ח ז ו ה ו א ב כ ך ש ב ת נ א י ם ה ד ר ו ש י ם ל א ל י פ י נ צ י ה של י ו ן
הדיניטדותיופנולט
- Sד י נ י ט ד ו פ נ י ל -צ י ם ט א י ן ,א י ן הריאקציה ס פ י צ י פ י ת לקבוצה ז ו ן גם ק ב ו צ ו ת צ י ס ט י ן ,
נ ו כ ח ו ת במולקולה העתידה להיבקע,
עלולות לעבוד תגובת אלימינציה דומה.
-27-
הפירוק האלקלי של פפטידי ציםטין נחקר כבר על ידי טרבל והרניש ) (122שהציעו מנגנון
לפיו הגשר הדיסולפידי עובר - pאלימינציה בימולקולרית.
מפחמן
המנגנון המוצע כולל הוצאת מיפן
על ידי התקפת יון הידרוכםיל מלווה בשחרור שייר - Sתיוציסטאיני.
שייר זה אינו
יציב ומתפרק הלאה ליון מרקפטיד ולגפרית חפשית:
0
-NH-C-COII
CH.
-NH-CH-COI
CH
-NH-C-COI
CH
2
0
ו
I
-
i
CH,
2״ז
s
-HN-CH-CO-
-HN-CH-CO2
I
-HN-CH-CO-
e
S
CH
-HN-CH-CO-
S
+
2
סימוכין למנגנון זה ניתן למצוא ביציבות היותר גדולה לאלקלי של
ציסטין )שאין בו מימני
( לעומת זו של ציםטין ).(123
של הפירוק האלקלי של כמה פפטידי ציםטין ).(124
דימתיל-
המנגנון נבדק לאהרונה במחקר קינטי
הופעת שייר הדהידרואלנין ויון הפרסולפיד
הראתה תלות מסדר ראשון הן ברכוז התרכובת הדיםולפידית והן ברכוז יון ההידרוכםיד ,ומכאן
שהיוניזציה לקרבאניון היא השלב הקובע מהירות.
ריאקציה ה - p -אלימינציה של קבוצות דיסולפידיות נחקרה גם בחלבונים ).(125
מהירות
האלימינציה בהלבונים גדולה בהרבה מזו שבפפטידי ציסטין .כך לדוגמא ,בעוד שבדיקרבובנזוקסי-
טין-דיאלנין זמן מחציה החיים של הריאקציה בNNaOH0.1-
ב 31°-היא
דקות
)372כמחושב
מחוך קבוע המהירות הבימולקולרי בטמפרטורה זו ) ,((124הרי בריבונוקליאזה באוחו רכוז אלקלי
וב 40°-זמן מחצית ההיים הוא פחות מ 3-דקות ).(125
-
28
-
אנו בדקנו את האלימינציה של קבוצות דיםולפידיות בריבונוקלאיזה באותם תנאים בהם
אלימינציה מלאה
P
מ
N
S
D
- S -דיניטרופניל-ריבונוקליאזה )NNaOH0.1
ב ,25^-למשך 30דקות( .כדי למנוע יצירת שיירי ליזינואלנין על ידי אינטראקציה בין שיירי
הדהידרואלנין הנוצרים בריאקציה ובין קבוצות - £אמינו של שיירי ליזין בחלבון ) ,(126נבדקה
האלימינציה בנגזרת .ה- N -אצטילית של ריבונוקליאזה.
אנהידיריד אצטי על ריבונוקליאזה ב M8 -אוריאה ב , -
וליאופיליזציה.
נגזרת זו הוכנה על ידי הפעלת עודף
3°ונוקתה על ידי דיאליזה נגד מים,
התוצר - Nאצטיל-ריבונוקליאזה הומם בתמיסת
ל 5-בעזרת חומצח חומץ מהולה.
כעבור ' 30דקות הורד ^pH
0.1Nהידרוכסיד הנתרן ב.25°-
כמות הדהידרואלנין בתוצר נקבעה
על ידי מדידה אנזימתית )באמצעות דהידרוגנזה לקטית )((127של החומצה הפירובית שנוצרה לאתר
מציח של דוגמא מהחלבון ב-
2
2
1N HCלמשך
-
'RCONH + CH COCOOH + H NR
2
3
2
שעות ב.(107) 105°
)±ב?
105°
RC0NHC-C0יNHR
II
—
י
™2
השואת תוצאות מדידת כמות החומצה הפירובית עם רכוז החלבון הסופי ,כפי שנקבע על
ידי אנליזת חומצות אמינו ,הראתה שמול הלבון הכיל 2.7שיירי דהידרואלנין .כדי לקבוע את
כמות שיירי חצי הציםטין שנותרו בריבונוקליאזה ,יובשה שארית החלבון וחומצנה עם חומצה
פרפורמית למשך שעתיים ב. -0°C
דוגמה מהחלבון המחומצן עברה הידרוליזח טוטלית ב12N HC -
והרכבה נקבע על ידי אנליזת הומצות אמינו.
לשם השואה נקבע גם הרכב החומצות האמיניות של
- Nאצטיל-ריבונוקליאזה שתופצן כנ״ל מבלי שעבד תהילה ריאקציה אלימינציה באלקלי.
טבלה מס׳ 1מראה אה הרכבי חחומצות האמיניות של שתי נגזרות החלבון.
מתוך השואת תכולת
ההומצה הציסטאית בשתי הדוגמאות ,נראה כי במהלך האלימינציה אבדו כשלשה שיירי חצי-ציסטין.
האלימינציה של קבוצות דיסולפיד בריבונוקליאזה נבדקה גם בתחומי pHיותר נמוכים.
על ריבונוקליאזה למשך 30דקות
ולקולה ההלבון.
ב 0 . 6 2 5 ° -
הפעלת בופר קרבונט-ביקרבונט
לאחר שעה באותה טמפרטורה.
10.9
הביאה ליצירת
pH
שיירי דהידרואלנין
לא גרמה ליצירת דהידרואלנין גם
-
;1
טבלה ' 0 0
הרכב החומצות ה א מ י נ י ו ת של
-Nאצטיל-ריבונוקליאזה
מחומצנת
9
2
-
נגזרות ריבונוקליאזה
N
-אצטיל-ריבונוקליאזה
מהומצנת לאהד ט י פ ו ל באלקלי
מספר ה ש י י ר י ם
לפי הספרות )(176
ליזין
9.72
9.74
10
היםטידין
3.45
3.27
4
ארגינין
3.80
3.75
4
חומצה ציםטאית
7.78
4.72
8
הומצה אםפרטיח
15.3
תריאונין
15
15.5
10
9.30
9.65
14.8
14.2
15
12.1
12.3
12
פרולין
4.2
4.3
4
גליצין
3.33
3.21
3
סר י ן
הומצה
גלוטמית
12.0
12.0
אלנין
8.32
ילין
12
8
8.17
-
4
איזולויצין
2.52
2.56
3
לויצין
2.30
2.41
2
מירוזין
5.64
5.58
6
פנילאלנין
2.78
2.84
3
-
מתיונין
כדי לאתר את הקבוצות ה ד י ם ו ל פ ו ד י ו ת שעברו
הופעלו על יתרת החלבון
התלבונית
אלה הל
בשיירי
אלימינציה
ה ד ה י ד ר ו א ל נ י נ י פ י תמצן א ל ק ל י י ם .
הדהידרואלנין
לפרגפנטים א פ י ד י י ם
ב ר י ב ו נ ו ק ל א ז ה0.1־NNa)1
0
H
בתוצאה מכך תל ב י ק ו ע של השרשרת
ולהידרוכסי-פירוביל-פפטידים.
בהנאים
נ י ה ו ק של הקבוצות ה ה י ד ר ו כ ס י -פ י ד ו ב י ל י ו ה ונתשפות הקבוצות ה א מ י נ י ו ת של התוןןצות
הסמוכות ל ש י י ר י
הדהידרואלנין
).(107
(
3 0 -־
OH
HC0 H
3
כ
״ CONH-C-CONHPep״Pep
1
II
2
CH-
Pep CONH-C-GONHPep
1
CH 0H
2
2
+ HOCH COOH + H2NPep
CO
׳<H0
) 2 2
COCONHPbp,
+
2
Pe C0NH
OH
P1
CH 0H
2
הקבוצות
הקצה
ה א פ י נ י ו ת החדשות נקבעו
פ ם ו ב פ ו ה בטבלה פסי
ב א נ ל י ז ת -ק צ ה ב ש י ט ת ה צ י א נ א מ ).(128
תוצאות אנליזת
.2
טבלה מם׳ 2
חומצה
אמינית קיצונית
0.13
ליזין
•חומצה
אםפרטיח
0.25
גליצין*
0.42
אלנין*
0.33
תומצה
גלוםמית
םרי ן
*
מול/מול
הלבוז
ע ר כ י ה ג ל י צ י ן ו א נ ל נ י ן ת ו ק נ ו מאחר ו ק י מ ת י צ י ר ה ב ל ת י
המשמשים ב ש י ט ת ה צ י א נ ט ) ר א ה הלק נ ס י ו נ י ( .
0.18
0.05
ס פ צ י פ י ת של ת ו מ צ ו ת א ל ה מ ה ר י א ג נ ט י ם
- 31 -
לצורך מציאת דרך לבקוע סלקטיבי של קשרי ציםטאין בחלבונים טבעיים המכילים שיירי
ציסטאין וציםטין ,או בחלבונים פחוזרים חלקית ,נחקרה אפשרות ההפיכה הסלקטיבית של נגזרות
ציםטאין לשיירי דהידרואלנין בנוכחות קבוצות דיסולפידיות.
.1
הבעיה נחקרה בשלשה כוונים:
מציאת תנאים )כגון טמפרטורה( בהם האלימינציה של קבוצה
SINPהיא סלקטיבית לגבי זו
של קבוצת דיםולפיד.
2ח י פ ו ש קבוצות עוזבות העוברות אלימינציה בתנאים יותר עדינים מאשר קבוצת•NP3SI.
.3
מודיפיקציות של קבוצות דיםולפיד לנגזרות שאינן עוברות ריקאצית לן -אלימינציה ,וזאת
בתנאים שאינם מפריעים לאלימינציה של קבוצות «SDNP
ן.
תלות מהירות האלימינציה של קבוצות
S-Sו-
SDNPבטמפרטורה
על מנת לבדוק אם ניתן להשיג בטמפרטורה נמוכה אלימינציה סלקטיבית של קבוצות SDNPלגבי
קבוצות דיסולםיד בהלבון ,נבדקה בטמפרטורות שונות הקינטיקה של היווצרות שיירי דיהידרואלנין
ב- S -דיניטרופניל-ריבונוקליאזה לעומה ריבונוקליאזה בעלת גשרי דיסולפיד שלמים .גם כאן
נחסמו תהילה קבוצוח ה-£ -אמינו של שיירי הליזין בחלבון ,כדי למנוע היווצרות שיירי ליזינואלנין.
אולם במקרה זו נבחרה כקבוצת הסיםה קבוצת הםוקציניל במקום האצטיל ,וזאת כדי לאפשר את מסיסות
הנגזרות החלבוניות באלקלי בטמפרטורות נמוכות ,הודות לקבוצה הקרבוכסילית החופשית של הנגזרת.
הםוקצינילית.
תכולת הדהידרואלנין נקבעה באמצעות אנליזה אנזימתית על החומצה הפידובית שנוצרה
ת הלבון בזמנים
קבוצות
ש ו נ י ם . . - 1 0 5 °דרגת האלימינציה של
SBNPנקבעה גם באופן ספקטרומטרי ,לפי בליעת יון הדיניטרו-תיופנולס ב־408
ציור מם׳ 1מראה את מהירויות האלימינציה של קבוצות
SDNPוקבוצות S-S
ב 25°-וב0°-
ב- N -סוקציניל-ריבונוקליאזה וב- N-סוקציניל-8 -דיניטרופניל-ריבונוקליאזה.
יה תוך 60דקות של קבוצות
S
-
3
S
. mp
יתסית לקבוצות DNP
התוצאות מראות כי
הוא 2.5) 32$מ1ל
לעומת 7.8מול למול חלבון( ,הרי ב ,0°-תוך 420דקות ,שעור האלימינציה היחסית יורד ל14$-
) 1.1מול לעומת 7.8מול למול חלבון(.
קבוצות S-S
מ 25°-ל.0°-
יחסית לזו של קבוצות
משמע שניתן להקטין בכ 60$-את מידה האלימינציה של
SDNPבריבונוקליאזה ,על ידי הורדת טמפרטורת הריאקציה
-
32
1
ז
120
-
ו
480
360 240
)T I M E ( min
ציור
מם 81
,
מהירות ה א ל י מ י נ צ י ה של קבוצות
פנגזרות
.1
שחרור קבוצות
ד י ב ו נ ו ק ל י א ז ה בתמיסת
דיניטדותיופנולט
םוקציניל-ריבונוקליאזה
.II
היווצרות שיירי
SENPו ק ב ו צ ו ת SS
NaOH1
0N״
.
- S-25ד י נ י ט ר ו פ נ י ל - N -
ב.25°-
ב-א-סוקציניל-רינובוקליאזה
דהידרואלנין
ב.25°-
.III
שחרור קבוצות
ד י נ י ט ר ו ת י ו פ נ ו ל ט מ - 8 -ד י נ י ט ר ו פ נ י ל -ז ! -
סוקציניל-ריבונוקליאזה
.IV
הווצרות שיירי
ב.0°-
דהידרואלנין
ב-ןן-סוקציניל-ריבונוקליאזה ב.0°-
- 33 -
.2
נםיונות בקבוצות עוזבות אחרות
א.
הקבוצה ה- s -פיקרילית
הואיל והאלימינציה של קבוצות דיםולפיד משיירי ציםטין היא אטית ב-
2
p Hו ומטה,
הרי שהפיכה סלקטיביה של נגזרות ציסטאין לשיירי דהידרואלנין בנוכחות שיירי ציםטין חיהכן
אילו נקשרה תהילה לשייר הציםטאיני קבוצה מושכת -אלקטרונים הזקה ,שתפעל כקבוצה עוזבת
באלימינציה בתחומי
. SENP
pHיותר נמוכים מאשר ,13הוא הpH -
שבו עוברת אלימינציה קבוצת
קבוצת הפיקריל ) - 6 ,4 ,2תריניטרופניל( מכילה קבוצת ניטרו נוספת על אלו שבקבוצת
, DNPולפיכך הקיבולת האלקטרונית שלה יותר גבוהה.
אגנט פיקירלציה השתמשנו בפיקריל כלוריד
C
H
C
)3 6 3 2,4,6
2
- N 0
)
1
.
פעולתו
על קבוצות תיאוליות נבדקה בריאקציוה של ריאגנט זה עם תרכבוה םולפהידריליות כגון מרקפמו-
יאקציות יצאו לפועל ב-
5.0
-
5.5
pH
החדר ,בריכוזים שבין
0.1
-
0,01
M
במהירות ובאופן כמותי )5 - 30
,וביחס ריאגנטים .(1.2 : 1
מהלך הריאקציה נעשה באמצעות טיטרציה יודומטרית של יתרת הקבוצה התיאולית.
לצורך שמירת
ההומוגניות הכילה תערובת הריאקציה ממיסים אורגניים כגון אצטון ודיאוקסן עד .40%
דומים נעשתה - Sפיקרילציה ל1?-
8
M
אוריאה.
המעקב אתר
בתנאים
אצטיל-ריבונוקלאזה שחוזרה תחילה עם מרקפטו-אתנול בתמיסת
דרגת ה-3 -פיקרילציה היתה ,92%שכן לאחר חמצון פרפורמי של התוצר המבודד נמצאו
במולקולה החלבון רק 0.6שיירי הומצה ציסמאית מתוך שמונה )ר' טבלה מם' .(1
כדי לבדוק את התכונות הספקטרליות על ההוםצה התיו-פיקרית ,שהיא תוצר-האלימינציה
הצפוי של נגזרות - Sפיקריל ציסטאין ,הוכנה ההומצה על ידי הפעלת עודף נתרן םולפידי על פיקריל
כלוריד באתנול.
ציור מם׳ 2מראה את• הספקטרום של הומצה תיו-פיקרית באתנול ובמים ).( pH 10
הממם משפיע הן על אורך הגל של הבליעה המקסימלית והן על האקםטינקציה המולרייז•
היא 1ך 425והבליעה המולרית =17200
. 1 4 2 0 0 = ^6
המקסימום הוא ב-
413
M
, £ובמים
^max
הוא גך 405והבליעה המולרית
בתערובוה מים -כהל מופיע המקסימום בין שני ערכים אלה )למשל ב 80%-אתנול
.(mu
- 34 -
500
450
400
350
)W A V E L E N G T H (m/t
ציור מסי :2
פיפית
ספקטרום הבליעה של תיופיקדט בתפיסת אתנול ) (1ובתםיסח
. ( p H)II)(10
-
בהמסת ^ ־ א צ ט י ל - S -פ י ק ר י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה ב -
בעלת בליעות מקסימליות ב -
אופיני
ניטרו
425
ו1-ן1ז1
NaOH
N
,נתקבלה תמיסה אדומה
) 425צ י ו ר מם' , 3ספקטרום .( I
ספקטרום זה
לתרכבות ה י ד ו ע ו ת כ ק ו מ פ ל כ ם י -מ י י ז נ ה י י מ ר ,ה נ ו צ ר ו ת על י ד י אינטראקציה של תרכבות
א ר ו מ ט י ו ת עם בסיסים ) .{149 , 1 4 8
מם' , 3ספקטרה
mp
0.1
485
11ןש
35
-
IIו -
ל4 0 5 . -
תוך כדי
.(III
הספקטרום השתנה בהדרגה עם ה ז מ ן ,במוראה ב צ י ו ר
י ר י ד ת הבליעה ב -ץ ח 485חלה העתקה של פס הבליעה
, m pשהוא כאמור א ו י ר הגל של הבליעה המקסימלית על
יון
התיו-פיקרט.
כאשר בוצעה הריאקציה בתמיסת 80$אתנול נתקבל תחילה ספקטרום דומה לספקטרום
הוא בהדרגה ,אלא שבמקרה זה הועתק הפס גבה -האנרגיה ל-טף ,413
קימת הבליעה המקסימלית של
22°
דקות(.
12,
י ו ן ה ת י ו -פ י ק ר ט בסביבה
0.01 N NaOH
הספקטרום של החמיסה
)
H
p
זו.
( הלה החמוםםות אטיח של החלבון
) צ י ו ר מסי , 4ספקטרום מסי
״בליעה
תמיסה צהובה ,בעלת הספקטרום מ ם ' 1 1ב צ י ו ר מם'
ב־-גך! 485בעוד שהפס ב1-ן1ס 405ה ו פ י ע כמקודם.
במקרה זה היתה הבליעה
כאן לא
נ י כ ר ע ו ד כל סימן לפס בליעה
כמות ה ד ה י ד ר ו א ל נ י ן שנוצרה ב ר י א ק צ י ו ת הללו נבדקה על י ד י
מסוכמות בטבלה מסי
זו
נובעת כנראה
דקות ובסיומה נתקבלה
.4
1
.3
)כ40-
ריאקציה ה א ל י מ י נ צ י ה נוסתה גם
M
ה ר י א ק צ י ו ת ב M HC2100°,-
-S
( Iדמה לםפקטרום הסופי של החלבון
מ ה י ו ו צ ר ו ת חומצה פיקרית שלה בליעה מקסימלית באורך-גל ז ה .
משכה כ
ז ה ו כאמור אורך הגל בו
כאשר הופעל על - Nא צ ט י ל -
בתמיסת , N NaOH0.1אלא שנוספה ל ו "כתף" של פס בליעה ב mp355 -
(.
Iשהשתנה אף
,
ב 1 -ף 1ז 3 5 5י ו ת ר מודגשת.
ה י ד ד ו ל י ז ה של ת ו צ ר י
וקביעה א נ ז י מ ת י ח של החומצה ה פ י ר ו ב י ה ש נ ו צ ר ה .
התוצאות
-
ציורמס׳;3
)
6
8x־10M־(5
מומסת
ב
ספקטרום
ה ב ל י ע ה של
( 0 . 1-I).
2דקותן
- 36
- Nאצטיל-3 -פיקדיל-דיבונוקליאזה
NaOH
) (IIל א ח ר 30ד ק ו ת ן
N
ל
א
ח
ר
) (IIIל א ח ד 90ד ק ו ת .
־37־
0.75
־<
{-
c
zo 0.50
UJ
Q
<
O
£ 0.25
_!
500
l
1
450
400
י—
350
)W A V E L E N G T H ( m/1
צ י ו ר מ ס י ?4
ספקטרום הבליעה של - Nא צ ט י ל - 8 -פ י ק ד י ל -ר י ב ו נ ו ק ל א ז ה
) ( Iבתמיסת ; & 0 H NN0.01בתמיסת)!!(
M־5־8x10
.0.1M
תריאתיל-אמין
6
- 38 -
מבלה מם׳ :3
יצירת שיירי דהידרואלנין בריאקציות אלימינציה של
ריבונוקליאזה
מם' שיירי דהידרואלנין
במול הלבון
ב ס י ם
^-אצטיל-3פיקריל-
ניצולת לגבי
קבוצות ציםטאיל )»(f
ניצולת לגבי קבוצות
פיקריל )( A0
0.1 N NaOH
4.4
55
59
0.01 N NaOH
3.9
49
53
0.1 M Et N
3
4.8
60
65
ציור מסי 5מראה אה מהירות ההיוצרות של שיירי דהידרואלנין בריאקציה האלימינציה
ב , I NNaOH.0-ואת הירידה הסימולטנית של הבליעה ב-גף.4851
ניתן לפרש את הממצאים שתוארו לעיל בכך שקבוצת ה-3-פיקריל-ציםטאין ,עוברת בתנאים
בסיסיים יצירה רברסיבלית של קומפלכס מייזנהיימר )
בלתי רברםיבלית ליצירת יון ההיו-פיקרט )
.(XXII
מייזנהימר עשויה לגרום גם ליצירת הומצה פיקרית )
CO-
— CH
— - HN
)גך ( XXIII) (405
-
— C O
,(XXIIבד בבד עם ריאקצית אלימינציה
ושייר דהידרואלנין.
יצירת קומפלכס
) (XXIVר' גם סעיף "דיון"(.
- HN — C H
־
39־
r
ז
90
ו
60
Time min.
30
י
ציור
,
מ ם :5
מ ה י ר ו ת י ר י ד ת הבליעה ב ( I ) 485 mp. -ו ה י ו צ ר ו ת ש י י ר י
1N NaOH״ 0על
) ( I Iבהפעלת
דהידרואלנין
^אצטיל- 8-פיקדיל-ריבונוקליאזה.
40 -״
במגמה לאתר את קבוצות ה - 8-פ י ק ר י ל שעברו
בריאקציה.
הנוצרים
מ ל ו ו ה במי חמצן
שבחלבון
אלימינציה,
תוצר הריאקציה בתמיסת תריאתילאמין
אלקליים.
( 52א נ ל י ז ת קבוצות
הראתה את כל קבוצות הקצה ה צ פ ו י ו ת )הסמוכות ל ש י י ר י
30$
ב.
ב י ק ע נ ו את ש י י ר י
י ו ב ש ו ה ו ג ב עם חומצה פרפורמית ב , 0 0 -
השלב האחרון נעשה בנוכתות פ נ ו ל במגמה להגן על ש י י ר י
מפני המצון )ראה להלן עמי
.5 -
הדהידרואלנין
התוצאות מסוכמות בטבלה מם׳
הטירוזין
-קצה של ח ו צ ר י ה ב י ק ו ע בשיטה הציאנט
ציםטאין
במולקולה החלבון(
ב נ י צ ו ל ו ת שבין
) . 8עמ* ( 74
הקבוצה ה ד נ מ י ל י ת
קבוצות
נגזרות
םרין
מרין
),104
הטוזיל
- 0א ר י ל -ס ו ל פ ו נ י ו ת מהוות קבוצות ע ו ז ב ו ת ט ו ב ו ת ב ר י א ק צ י ו ה א ל י מ י נ י צ י ה של
לשיירי
,(105
דהידרואלנין.
וכן
דוגמאוה לכך הן
ר י א ק צ י ו ת ה א ל י מ י נ י צ י ה של פפטידי
-0טוזיל-
י צ י ר ת " א נ ה י ד ר ו -כ י מ ו ט ר י פ ם י ן " מ - 0 -ט ו ז י ל -כ י מ ו ט ר י פ ם י ן שבו קשורה קבוצת
ל ש י י ר הסרין הפעיל מם'
-אמינו-נפתלן- 5 -םולפונילית(
, 1 0 9 ) 195
מצאנ\ שגם הקבוצה
.(110
ה-0-דנסילית )ו-דימתיל-
י כ ו ל ה לשמש כקבוצה ע ו ז ב ת טובה בהפיכת ש י י ר י
םרין
לדהידרואלנין.
לשם כך ה כ י נ ו נ ו - 0ד נ ם י ל -כ י מ ו ט ר י פ ס י ן שהכיל קבוצה ד נ ס י ל י ת אחת על כל מולקולה של
אנזים;
על
י ד י הפעלת דנסיל פ ל ו ר י ד על
-כימוטריפסין
וםניל־־מתן-םולפוניל פלוריד
טוזיל
פלוריד
הפעיל
ב כ י מ ו ט ר י פ ס י ן מאשר ה ס ו ל פ ו נ י ל
ב-
7
י ד ו ע י ם כבעלי
כ ל ו ר י ד י ם המתאימימ
. p H
סלקטיביות
).((132
)סולפוניל פלורידים כגון
י ו ת ר גבוהה ל ג ב י ש י י ר הסדין
גם ד נ ס י ל פ ל ו ר י ד נמצא
יותר
-
פאשר ה כ ל ו ר י ד ,שכן ה ו א ג ר ם
סלקטיבי
ב ע ו ד שאצל ד נ ס י ל
כימוטריפסין
שונה
כ ל ו ר י ד היחס הוא בערך ! 1
אהד ב מ ו ל ק ו ל ה .
עם פ ל י ט ה מ ק ס י מ ל י ת ב1-ףג1
נ מ ו כ י ם עד
ברכוזים
לאור
עוזבת
כרוכה
בקשיים.
)(133
^ 7
)
פלואורםצנטית,
.460
ה ב ד ל ז ה מאפשר מ ע ק ב פ ל ו א ו ר ו מ ט ד י
נ ו ה אתר ר י א ק צ י ה ה א ל י מ י נ צ י ה ,
^" 10מ ו ל ד .
ה א ל י מ י נ צ י ה של ש י י ר י
גיבסון
) (134ה כ י ן
יוצרת ג ל ו ט ת י ו ן מהומצן
ניסינו
להכין
תיו-םולפונטים
םונדרס
י * RSO^SRב נ י צ ו ל ו ת
) (135מצא ש ה פ ע ל ת נ פ ת ל ן
והוםצה נפתלן
א ל ק ט ר ו פ ו ר ז ה על ת ו צ ר י ה ר י א ק צ י ה
)
דנםיליה.
- 2 -םולפינית־
הומצות
זוהה
) צ י ו ר מם׳
(6הראתה כ י
איפא בחומצה
ל ע ו מ ת זאת ד י ו ו ה הרטלי
o־ 7
נוצרו
. p H
ל ג ל ו ט ת י ו ן ) ( GSH
גלוטתיון פהומצן
נ ו ס ף ב ע ל ה ו מ צ י ו ה פ ת ו ת ה מ ז ו של ה ו מ צ ה
ה ו צ ר ז ה ה פ ר ל ה ו מ צ ה ד נ ס י ל י ה ע ל י ד י ר י א ק צ י ה עם
יוד ואלקלי.
הםולפוניל-יודיד(
-1דימתילאמינו-נפתלן-5-םולפינית.
י ד י ת ג ו ב ה של
- 2 -סולפוניל-כלוריד
הוספת ד נ ם י ל כ ל ו ר י ד
והוצר פלואורסצנטי
ס ו ל פ י נ י ו ת לתומצות ס ו ל פ ו נ י ו ת )דיר
נ מ ו כ ו ת על י ד י ר י א ק צ י ה
ב נ ו כ ת ו ת פ י ר י ד י ן ,א ו על
- 8ד נ ם י ל -ג ל ו ט ת י ו ן על י ד י
, ( G S S Gהומצה ד נ ס י ל י ה ,
א נ ל ו ג י כקבוצה
צ י ם ט א י ן ,א ו ל ם מ ת ב ר ר ש ס ו ל פ ו נ י ל צ י ה של ק ב ו צ ו ת ת י א ו ל י ו ת
ע ל י צ י ר ה - Sד נ ס י ל -צ י ם ט א י ן ב ה פ ע ל ת ד נ ם י ל כ ל ו ר י ד על צ י ם ט א י ן ת ו פ ש י
אנו
(86%
ו י ת ר ו נ ה כקבוצה עוזבת
ו א י ל ו ההומצה ה ד נ ס י ל י ת היא בעלת פ ל ו א ו ר ס צ נ ס י ה כ ה ו ל ה -י ר ו ק ה ,
י ו ד י ד י ם עם מ ר ק פ ט י ד י כ ס ף .
גלוטתיון
. p H
על
-0דנםיל
הקבוצה ה - 0 -ד נ ם י ל י ת היא בעלת פ ל א ו ר ם צ נ ס י ה צהובה
ם ו ל פ ו נ י ל כ ל ו ד י ד י ם עם מ ר ק פ ט נ י ם ב ת מ י ם ו ה ב נ ז ן
סולפוניל
.(133ה פ ע ל ת IN NaOH.0
ז א ת נ י ה ן ה י ה ל צ פ ו ת ש ה ק ב ו צ ה ה - S -ד נ ם י ל י ת ת ו כ ל לשמש ב א ו פ ן
בריאקציה
על
הקבוצה ה ד נ ם י ל י ת היא
מ ז ו של ה ק ב ו צ ה ה - 0 -ד נ ס י ל י ה .
וזאה
2-3
),132
ה א נ ז י ם ב י ח ס ס ו ל ר י של : 1
ה א ל י מ י נ צ י ה הוא בכך שתוצר ה א ל י מ י נ צ י ה -הומצה ד נ ס י ל י ת -היא בעלת פ ל ו א ו ר ם צ נ ס י ה
עם פ ל י ט ה מ ק ס י מ ל י ה ב1-ףז520 1
של
ל א י נ א ק ם י ב צ י ה פ ל א ה של
1.4
ג ר מ ה ל ש ח ר ו ר כ מ ו ת י של ח ו מ צ ה ד נ ס י ל י ת ו ל י צ י ר ת א נ ה י ד ר ו -כ י מ ו ט ר י פ ס י ן ב ע ל ש י י ר
דהידרואלנין
בריאקציה
- 41
).(XXV
ב ת נ א י ם אלה ה ו פ כ ו ה
) (137ה ת ו צ ר ה פ ל ו ר ס צ נ ט י
הנוסף
- 42 -
©
O
O
o
I
I
I
I
J
5
4
3
2
I
0
ציור
פס
,
;6
א ל ק ט ר ו פ ו ר ז ה ) (pH 3.5של ת ו צ ר י
כלוריד וגלוטתיון.
- 2תוצרי הריאקציה
- 1חומצה ד נ ס י ל י ת
- 4גלוטתיון מחוזר
ח מ צ ו ן עם י ו ד
כחמים
כתמים
מקווקוים
ריקים
-
5
הריאקציה שבין
דנסיל
- 3ת ו צ ר י ה ר י א ק צ י ה לאחר
-גלוטתיון מחומצן.
נינהידריניים.
פלואורסצנטיים.
- 43 -
S0 C1
2
+ HC1
+
GSSG
GSH +
(CH3) N
2
)(XXV
אה יצירה הדיסולפיד וההופצה הםולפיניה ניתן להסביר על סמך העובדה שפרקפטנים
פגיבים עם היוםולפונםים הוך יצירת דיםולפידים וחופצוה סולפיניות ).(138
^
"RSO H + R'SSR
יצירת הדיסולפיד בתגובה שבין דנםיל כלוריד וגלוטתיון עלולה איפא להול בשני שלבים:
א.
תהילה נוצר
ב«
-8דנסיל-גלוטתיו ן כתוצר ביניים.
יתרת הגלוטהיון החפשי מגיבה
עם הוצר הביניים תוך יצירת הדיםולפיד והחומצה הסולפינית
MS0 -SG
*
1) GSH + DNS0 C1
MfS0 H + GSSG
}
0SG + GSH״2) DNS
2
2
2
2
) DNS0־־ ו-דימתיל-אמינו-נפתלן-5-םולפוניל(.
2
כדי למנוע את שלב ב' ניסינו להכין -8דנסיל גלוטתיון על ידי הוספה אטית מאד
של גלוטתיון לתוך עודף דנסיל כלוריד ,אולם התוצאות לא השתנו ושוב התקבל גלוטחיון מחומצן
דרך אהרה בה ניסינו לקבל את התוצר המבוקש היתה לבצע את הריאקציה כאשר הגלוטתיון ספות
לשרף מהליף היונים . Amberlite - IR- 45
הריאקציה קיווינו למנוע את שלב בי.
הואיל וכך אין הגלוטתיון הופשי לנוע בתערובת
מכיון שבתנאים אלה חייבת הריאקציה להיעשוה בסביבה
אל-פיפיה ובהעדר בסיס )כדי לפנוע ירידה הגלוטהיון מהשרף( הפכנו אה הגלוטהיון הספוה
למרקפטיד-כסף.
בדם הפעלת דנסיל כלוריד בתפיסת דיפתיל אצטאפיד על הפרקפטיד לא הביאה
לתוצאות המקוווה והגלוטתיון שוהרר פהשרף על ידי פירידין אצטט בתור גלוטתיון הופשי )לא
פתומצן(.
-
הנהנו
כי
ניסינו,
איפא,
להכין S
פחוזרח,
א ו ל ם ללא הצלחה־
שלא
בחלבון עשויה
חופצי
ידי
של ה ח ל ב ו ן
הפעלה
.3
ב כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה על ם פ ד ק ם ב ו ד ד ה
- N-£דנסיל-ליזין.
פםהבד א י פ א ,
שיירי
נבעה פ נ ו כ ת ו ת ק ב ו צ ו ת
ל ע ו מ ת זאת לא ש ו ח ר ר ו
נגזרות
-1דימתילאפינו-
^ ד נ ם י ל י ו ת ,שכן
בהידרוליזט
ק ב ו צ ו ח ד נ ס י ל י ו ת מ ה ח ל ב ו ן על
ש ג ם י ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה גרפה ה ד נ ס י ל צ י ה לחפצון
)כנראה
של ח ק ב ו צ ו ת ה ת י א ו ל י ו ת ־
אחר ב ו
ב י כ ו ל ה הקבוצה
שאינה
ריבונוקליאזה
נגזרת ריבונוקליאזה פלואורםצנטית
SDNP
נ ג ש נ ו ל ב ע י ו ז ה ה פ י כ ה ה ס ל ק ט י ב י ת של ש י י ר י
צ י ם ט י ן ,ה ו א ח י פ ו ש א ח ר פ ו ד י פ י ק צ י ו ת של ק ב ו צ ו ת צ י ם ט י ן
לעבור אלימינציה
במודיפקציות
להיות
ו כ ן ת ע ר ו ב ת של ח ו פ צ ה ד נ ם י ל י ת ו ח ו פ צ ה
ה פ ל א ו ר ם צ נ ם י ה של ה ה ל ב ו ן
נפצא
י ו ת ר א ט י ח מאשר ב פ פ ט י ד י ם ־
י ד י ה פ ע ל ת ד נ ם י ל כ ל ו ר י ד על
מ ו ד י פ י ק צ י ו ת של ק ב ו צ ו ת ד י ס ו ל פ י ד ו ה ש פ ע ת ן ע ל ק ב ו צ ת
כוון
א*
-ד נ ם י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה על
0 . 1 N NaOH־
אינטרמולקולרי(
תפגענה
י צ י ר ת ה ד י ם ו ל פ י ד י ם )שלב ב י (
הכילה עוד קבוצות תיאוליות חופשיות,
נפתלן-5-סולפינית.
- 44
ב
כ א ל ה יש ל ה פ ו ך את ה ק ב ו צ ה
י כ ו ל ה לשמש ע ו ד כ ק ב ו צ ה ע ו ז ב ת .
טעונות שלילית
~RSCH C00
2
ב.
חמצון
ג.
םולפיטוליזח
ל נ ג ז ר ו ת שלא ת ע ב ו ר נ ה ר י א ק צ י ת
N
P
ה ד י ם ו ל פ י ד י ת של ש י י ר ה צ י ם ט י ן
נ י ת ו ק קשרי
D
S
N NaOH0.1 -
ה ד י ם ו ל פ י ד של ש י י ר י
יצירת שיירי
»
C
? °°
I C H
S
-
ציםטין תוך
יצירת
קרבוכסימתיל-ציםטאין
] [ H
RSH
RSSR
ל ש י י ר י הומצה ציםטאית
HCO^H
לנגזרוח
RSSR
-8סולפו-ציםטאין
RS~ + RSSO.
־S0,
>—2
RSSR
S 0
4 6
בדקנו
אה השפעת שלשת ס ו ג י
ה מ ו ד י פ י ק צ י ו ת על ק ב ו צ ו ח
S
.
לקבוצה טעונה שלילית,
י כ ו ל ל ה י ע ש ו ת בשלש ד ר כ י ם :
ח י ז ו ר מלווה בקרבוכסימתילגיה תוך
פרפרומי
ציסטאין
לדהידרואלנין
בנוכתות
-דיניטרופניל-ציסטאין.
- 45 -
א.
חיזור
חיזור הקשרים הדיםולפידיי ים של שיירי ציםטין יכול להיעשות בשתי דרכים ).(139
) (iבעזרה ריאגנטים תיאוליים״
)(ii
בעזרת נהרן-בורוהידריד.
הריאגנטים התיאוליים העיקריים הפשפשים להיזור קשרי דיםולפיד הם ^ -םרקפטואתנול,
הופצה תיוגליקולית וציסטאפין ) 3ן-מרקפטואתילאמין( ).(139
םוקולובסקי ) (140פטר על
פי נםיונות פוקדפים כי פרקפטואהנול מוריד כנראה את קבוצת הדיניטרופניל פתיאול הציסטאין.
אישרנו פימצא זה על ידי הפעלת מרקפטואתנול על 8-דיניטרופניל-ריבונוקליאזה בתפיסת
אוריאה ב-
8.5
pH
לפשך שעה.
M8
הפרדת החלבון הראתה כי כל קבוצות הדיניטרופניל נוהקו
מהחלבון בזפן הריאקציה ,שכן להוצר לא היתה יותר בליעה אופטית ב1-ןנ 4081בתפיסת NaOH
N•0.1
כדי לבדוק א& התקפת הריאגנט התיאולי הלה על הפהפן הפתילני של השייר הציסטאיני
)הוך יציאת -4,2דיניטרותיופנולט( או על פהפן הטבעת הדיניטרופנילית )תוך ניתוק הקשר
ההיו-אתרי עם הטבעת( הוגבה - Sדיניטרופניל-ריבונוקליאזה עם ציםטאפין בתנאים הנ״ל.
ההלבון שהופרד מתערובת הריאקציה הכיל ,לאחר חמצון עם חומצה פרפורפית 7.8 ,שיירי הופצה
#
ציסטאית לעומת פחות מ 0.2-שיירי חומצה זו שנמצאו ב-
ההגובה עם ציםטאמין־
ציםטאין(.
-8דיניטרופניל-ריבונוקליאזה
לעומח זאה לא הכיל החוצר החלבוני שיירי תיאוליזין )
לפני
-8אפינואתיל-
מכאן שהתקפת הריאגנט התיאולי גורמת לניתוק הקשר התיו-אהרי ליד הטבעת
הדיניטרופנילית.
מתערובת הריאקציה בודד גם הומר צהוב ) ג1ף= 360
בעל קבוצה תיאוליה ,שהוא כנראה - Nדיניטרופניל-ציםטאמין )
S-4Nשל הוצר הביניים - Sדיניטרופניל-ציםטאמין )(*)(XXVI.
m a x
( Xבלתי בסיסי
( XXVIIהנוצר על ידי שהלוף
141
* בעח ובעונח אחה עם עבודה זו מצא שאלתיאל ) (142ריאקציה דומה עם - S,Nוי־
דיניטרופניל-היםטידין ו- 0 -דיניטרופניל-)דיניטרופניל(-ציסטאין וכן עם נגזרות
טידוזין(.
- 46 -
— -HN-CH-CO
-NH-CH-CO-
I
I
CH
CH
I 2
H NCH CH SH
SH
2
2
2
NO,
NO,
NHCH CH SH
2 2
H NCH CH S
2
2 2
)(XXVI
)(XXVII
הפעלת
גרמה
NaBH
4
- 8ד י נ י ט ר ו פ נ י ל -ג ל ו ט ח י ו ן א ו על
ל ה ע ל מ ו ת הצבע הצהוב ה א ו פ י נ י
על ת ו צ ר י
הטבעת
ליות
על
נ ת ז ר ו ת על י ד י
לקבוצת
ה ר י א ק צ י ו ת לא נ ו צ ר ע ו ד י ו ן
ה א ר ו מ ט י ת של ה ק ב ו צ ה ה S -
NaHH
, SDNP
ו ל ה ו פ ע ת צבע ח ו ם .
הדיניטרו-תיופנולט.
-דיניטרופנילית.
לנגזרות
8-דיניטרופניל-ריבונוקליאזה
סברין
O.lNNaOH
בהפעלת
גרם
יש לשערש-NaBH
4
) (169מצא כ י
ד נ י ט ר ו צ י ק ל ו ה ק ס נ י ו ת
4
תרכבות
לחיזור
- 4,2
.
X
2
N0
NaBHx
H
>3
2
H
NOo
ב.
H
ת מ צ ו ן
תמצון
את השפעת ה ח י מ צ ו ן
S
)(X = C I , CH COOH
קשרי
ד י ם ו ל פ י ד ל ק ב ו צ ו ת ם ו ל פ ו נ י ו ת נעשה ע ״ י ח ו מ צ ה פ ר פ ו ר מ י ת .
ה פ ר פ ו ר מ י על ק ב ו צ ו ת
-ד י נ י ט ר ו פ נ י ל -ג ל ו ט ת י ו ן ועל S
הוגבו
S D N Pה ו פ ע ל ה הומצה פ ר פ ו ר מ י ת ב -
,
-דיניטרופניל-ריבונוקליאזה.
ה ת ו צ ר י ם עם N NaOH0.1ו נ ת ק ב ל ו
ה י ד ר ו ל י ז ה של ה ת ו צ ר י ם ב , 1 NHC2-
)שעתיים
ב
כדי לבדוק
C0°
על
לאחר הרחקת ה ה ו מ צ ה ה פ ר פ ו ר מ י ת
ת מ י ס ו ת ב ע ל ו ת צ ב ע א ד ו ם ע מ ו ק ,ש נ ע ל ם בההמצה. ,
(
משמע שלא ח ל ה ב א ל ק ל י ר י א ק צ י ה א ל י מ י נ צ י ה ו ל א
- 1 0 0 °ל א גרמה ל ה י ו ו צ ר ו ת חומצה פ י ר ו ב י ת .
נוצרו שיירי
דהידרואלנין.
- 47 -
אה יכולהה של קבוצת ה SDNP -לעבור אלימינציה לאהד הריאקציה עם חומצה פרפורמית
ניתן להסביר בכך שההומצה הפרפורמיה גרמה כנראה להמצון הקבוצה הםולפידיה לקבוצה םולפיניה
קבוצה זו ידועה כקבוצה מושכה -אלקטרונים הזקה המפעילה קבוצה מתילניה שכנה ,וגורמה
ליוניזציה קלה של המימן הסמוך לה ,על ידי ייצוב הקרבאניון הנוצר תוך כדי כך ),(144 ,143
ייתכן איפא שהפעלת אלקלי על הוצר החיפצון הפרפורפי גורפה ליוניזציה של הפיפן על הפהמן -
יוניזציה כזו פונעת אפשרות של ריאקצית
^ -של השייר הציםטאיני בפקום על הפחפן . c>-
אליפינציה.
-NH-CH-COI
e
-NH-CH-CO©
,
f
7
0=s-0
I
DNP
f
*
I
\_0tf
0=5=0
I
7
-NH-CH-COI
f 2
0=3=0
-NH-CH-COI
HCO,H
7
I
DNP
DNP
f2
S
I
DNP
ג .סולפיטוליזה
סולפיטוליזה של תרכבות דיםולפידיות לנגזרות - Sסולפו נעשיה על ידי הפעלת
עודף נהרן םולפיט ב-
7
-
8 p H־
הקבוצה הדיםולפידית הופכת לקבוצת -8סולפו ולקבוצה
תיאולית .כדי להשיג הפיכה כמותית על התרכובת הדיםולפידית לנגזרת - Sסולפו יש להפצן
מהדש את הקבוצות התיאוליוה לקבוצוה דיםולפידיות על ידי מחפצנים עדינים כגון נתרן
טטרה-חיונט או יודוזובנזואט )(139״
נגזרת - S-nסולפו באופן כמותי .־
לאחר מחזורים אחדים של הםצון וםולפיטליזה מתקבלת
•
כדי לבדוק את מידת האלימנציה של קבוצת -8סולפו בתנאים אלקלייש ,הכינונו
- Sםולפו-גלוטתיון ו- S -םולפו-ריבונוקליאזה לפי שיטת ביילי ).(145
ע-סולפו-גלוטתיון
הוכן על ידי הפעלת נתרן סולפיט (M)0.5ונתרן-טטרה-תיונט (M)0.5על גלוטתיון « p H ^ 7
- 48 -
כמותיות הריאקציה אושרה על ידי אלקטרופוריזה ב-
3.5
pH
)יחם מהירויות הנדידה אל האנודה
של גלוטתיון מחוזר ,גלוטתיון מחומצן ו-3 -סולפו-גלוטתיון ב pH -זה הוא 1.36 ,1.00
ו— ,2.95כהתאמה(.
-8סולפו-ריבונוקליאזה הוכנה על ידי 3מחזורי סולפיטוליזה וחפצון
עם נתרן םולפיט ) (M0.2ונתרן טטרה-תיונט ) (0.2Mב 8M ,38°-אוריאה H! «7.4 ,והופרדה
על קולונת םפדקם.
הפעלת
0.1
על
N NaOH
-Sםולפוגלוטתיון למשך 30דקות גרמה ליצירת 0.05 - 0.1
שיירי דהידדואלנין למול ,כפי שנקבע על ידי מדידת כמות החומצה הפירוביה הנוצרת בהידרוליזה
תומצית.
הפעלת
0.1
N NaQH
שיירי דהידרואלנין.
על - Sםולפו-ריבונוקליאזה באותם תנאים גרמה ליצירת 0.47
בהידרוליזה טוטלית של תוצר הריאקציה לא נמצאו שיירי ליזינואלנין
ומכאן ששעור האלימינציה ב-8 -םולפו-ריבונוקליאזה הוא .5 - 6$
בתנאים זהים עוברת
- Sדיניטרופניל-ריבונוקליאזה אלימינציה כמותית ,ואילו ב-^-אצטיל-ריבונוקליאזה היה
שיעור האלימינציה באותם תנאים ) 34$עמי ( 28משמע שקבוצת
- Sסולפו היא קבוצה עוזבת פחות
טובה מקבוצת הדיםולפיד ,וזאת כנראה עקב מטענה השלילי.
כדי לבדוק את מידת יציבות קבוצה ה-S -דיניטרופניל בתנאי הםולפיטוליזה על הלבונים
הפעלנו 0MNaS0.2-על - Sדיניטרופניל-גלוטתיון-38°pH7 . 4 ^ ,ב
למשך פרקי זמן שונים.
אנליזה כרומטוגרפית של תערובת הריאקציה הראתה כי הל ניתוק אטי על הקבוצה הדיניטרופנילית
תוך יצירת גלוטתיון חופשי .כדי לעקוב אחר מהירות הריאקציה בדקנו את נוכחות קבוצה ^SDNP
,ע ל ידי מדידה ספקטרופוטומטדיח של יון הדיניטרותיופנולט
הפעלת
NaOHעל דוגמאות של תערובת הריאקציה.
של קבוצת ^ SDNPמ-8-דיניטרופניל-גלוטתיון.
דיניטרופניל-ריבונוקליאזה.
ציוד מם' 7מראה את עקומת מחירות ההיעלמות
נסיון דומה ערכנו ב^ -םוקציניל-S -
בתרנו בנגזרת זו כי הקבוצה הסוקצינילית מאפשרת את המסת
ההלבון ה-8 -דיניטרופנילי ^ p Hהבסיסי ההלש הדרוש לריאקציה הםולפיטוליזה .כמו כן
מאפשרת הקבוצה הסוקציניליה להפריד את התלבון מתוך תערובת הריאקציה על ידי ההמצה ל-
2-3
. p H
-
60
40
50
- 49
30
10
20
)Time (min
נ י ת ו ק קבוצת
צ י ו ר מ ם ' :7
3
) M־(10x1.44
_ .380
ב
על י ד י
SDNP
נתרן
מ - 8 -ד י נ י ט ר ו פ נ י ל -ג ל ו ט ת י ו ן
סולפיט )
0.2
M
ב( , H7.4P
_L
1
50
60
1
1
1
40
30
20
)(min
י־
10
Time
קציניל-8 -דיניטרופניל-
ניתוק קבוצותN-aSDNP-10
ציור מ ס :8
( Mבתפיסת
ריבונוקליאזה על ידי נתרן סולפיט ) 0 . 2
, p Hב.38° -
8.2
Mאוריאה,
8
,
- 51 -
ציור מס׳ 8מראה את מהירות היעלמות קבוצות
יאזה בהפעלת נתרן סולפיט
0.2
M
SDNPפ-^ -סוקציניל-8 -דיניטרופניל-ריבונ ו-
בתמיסת אודיאהpH,88.2
M
,ב .38°-שני הניסויים
הללו מראים איפא כי יוני סולפיט גורמים לניתוק אטי של הקבוצה הדיניטרופנילית מתרכובות
- Sדיניטרופניליות ,כנראה לפי המשואה! הבאה:
-HN-CH-CO-
-NH-CH-C0-
לסיכום סעיף זה ניתן לקבוע כי כל שלשת סוגי המודיפיקציות של קבוצות דיסולפידיות
שנוסו ,פוגעות גם
בקבוצת
. SDNP
יותר אטית מאשר שאר המודיפיקציות־
עם זאת מתברר שהסולפיטוליזה של קבוצות
SDNPהינה
השואה עם תוצאות עבודתו של ביילי ) (145מראה גם
שמהירות הסולפיטליזה של קבוצות דיסולפידיות לקבוצות - Sסולפו ולקבוצות תיאוליות גדולה
במידה ניכרת ממהירות הםולפיטוליזה של קבוצת SIKPבאותם תנאים.
תופעה זו ,והאפשרות
הנובעת ממנה להפיכה סלקטיבית של שיירי - Sדיניטרופניל-ציסטאין לנגזרות דהידרואלנין
בנוכחות שיירייציםטין תידון להלן בסעיף "דיון".
52 -
.II
1־
ע ל י ד י מ י חמצז
הפרגמנט
נגזרתו
ב י ק ו ע קשרי N
-
-פירוביל
אלקליים
הפפטידי ה -
הפירובילית או
הנוצר בביקוע פפטידי
-0תרמינלי
ה-11-הידרוכםי-פירובילית.
על מ נ ת ל ז ה ו ת את החומצה ה א מ י נ י ת
ה ק י צ ו נ י ת של ה מ ק ט ע ה פ פ ט י ד י יש ל ה ו ש פ ה ע ל י ד י ה ס ר ה ה ק ב ו צ ה
פירוביליה.
שיטת
פצ׳ורניק
מקגרגור
ד ה י ד ר ו א ל נ י ן מתקבל בתור
ה פ י ר ו ב י ל י ה או
ו ס ו ק ו ל ו ב ם ק י ) (107עשו ז א ה ע ל י ד י ה פ ע ל ת מ י ה מ צ ן
ה-א-הידרוכסי
אלקליים לפי
ו ק ר פ נ ט ר ).(146
0
־־0
^CH
(P
^ C H ^ - C — C - N H R
0
הם הראו כ י
ניתן
בה בבקוע פפטידי
OH—0
ל ה ו ר י ד ב ש י ט ה ז ו א ה ה ק ב ו צ ה ה פ י ר ו ב י ל י ת ב נ י צ ו ל ו ה של ,50 - 60%ו א ף השתמשו
כ ש ה פ ע י ל ו את ש י ט ת ה ח י ת י ר ב ב ק ו ע קשרי
צ י ם ט א י ן ),(103
הציםטאין
בריבונוקליאזה
) (108מ צ א ו ר ק שבעה מ ת ו ך ש מ ו נ ת ה ש י י ר י ם ה צ פ ו י י ם של ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ק י צ ו נ י ו ת ה ס מ ו כ ו ת
לציסטאין
השמיני,
)חומצח אספרטיח חומצה
גלוטמיה,
סדין,
אלנין,
ט י ר ו ז י ן לא נמצא על י ד ם .על ם ם ו ז ה ה ו ט ל ס פ ק
ארגינין
ושני שיירי
ב ק י ו מ ו של הקשר
ליזין(.
השייר
ציסטאין-טירוזין
בריבונוקליאזה.
ב ח ק ר נ ו א ת שאלת ק י ו מ ו של הקשר
שייר
טירוזין
מ י חמצן
ת ר מ י נ ל י לאחר ב י ק ו ע
ציסטאין-טירוזין
ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה מצאנו שאי-הופעת
ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה נובעת מהריסת שיירי
א ל ק ל י י ם בשלב ה ר ב י ע י של ש י ט ת ה ה י ה ו ך
ט י ד ו ז י ן על י ד י הפעלת
)הסרת ק ב ו צ ו ת - Nה י ד ר ו כ ם י -פ י ר ו ב י ל ( .
- 53 -
,
מבלה מס :4
הרכב החומצות האמיניותשל ריבונוקליאזה בשלבי תהליר הביקוע
הומצה אמינית
ריבונוקליאזה
טבעית
-3דיניטרופניל
ריבונוקליאזה
דהידרואלנין -ריבונוקליאזה מסי השיירים
לפי הםפרות)(176
מבוקעת
ריבונוקליאזה
v
י
ליזין
9.5
9.7
9.7
9.1
10
היםטידין
3.5
3.35
3.4
3.5
4
ארגינין
3.8
3.8
3.5
3.7
4
חומצה אספרטית
15.0
15.0
15.0
16.5
15
תריאוני ן
9.6
9.6
9.7
9.5
10
סדין
14.5
14.3
14.5
14.2
15
הומצה גלוטמית
12.1
12.3
12.3
12.1
12
פרולין
4.1
4.3
4.4
4.2
4
גליצין
3.3
3.1
3.3
3.0
3
אלנין
12.2
11.9
12.2
12.0
12
ילין
9.2
9.3
8.9
8.5
9
3.7
3.6
3.4
-
4
איזולויצין
2.7
2.6
2.6
2.6
3
לויצין
1.9
1.8
2.1
2.0
2
טירוזין
5.9
5.9
5.7
2.2
6
פנילאלנין
2.8
2.7
2.8
2.6
3
מתיו ני ן
-
-
54
ט ב ל ה מ ם ' 4מ ר א ה את ה ר כ ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י נ י ו ת של ר י ב ו נ ו ק ל י י א ז ה ב ש ל ב י ם ש ו נ י ם ב ת ה ל י ך
הביקוע.
הסופי.
גורם
נ י ת ן לראות כי
השנוי הבולט ביותר הוא בתכולת שיירי
ה ה י פ צ ו ן ה פ ר פ ו ר מ י של
ד ה י ד ר ו א ל נ י ן -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה ה מ ל ו ו ה בהפעלת מי המצן א ל ק ל י י ם
ל ה ע ל מ ו ת של ק ר ו ב ל א ר ב ע ה מ ת ו ך ששת ש י י ר י
בקשנו
בנוכתות
שייתחרו
ל ב ד ו ק אם
הומרים דמויי
עם
ניתן
הטירוזין שבהלבון.
ל מ נ ו ע את ה ר י ס ת ש י י ר י
טירוזין
כגון
פ נ ו ל והוםצה
ה ט י ר ו ז י ן על ה ר י א ג נ ט ה מ ח מ צ ן .
ה ט י ר ו ז י ן על י ד י
פלורטית
ב י צ ו ע השלב ה מ ה מ צ ן
) - pה י ד ר ו כ ס י -לן -פ נ י ל -פ ר ו פ י ו נ י ת (
לשם כ ך ה פ ע ל נ ו את ש י ט ת ה ב י ק ו ע על ת ע ר ו ב ת א ק ו י -
מ ו ל ר י ת של - Nק ר ב ו ב נ ז ו ק ם י - 8 -ד י נ י ט ר ו פ נ י ל -
-
ה ט י ר ו ז י ז ל א ה ר שלב ה ב י ק ו ע
-0אצסיל-ציסטאיניל-טירוזין-אפיד
ו-^ -קרבונזוקםי
-8דיניטרופניל-ציםטאיניל-לויצין־
ב ו צ ע ה ה י ה ו ך ב ה נ א י ם ה ר ג י ל י ם ,ל ל א ה ג נ ה על
תחילה
הביקוע תוך הוספת עודף )פי
א נ ל י ז ה קצה של ת ו צ ר י
(100ש ל פ נ ו ל א ו
הטירוזין,
ו א ח ״ כ ח ז ר נ ו על תחליך
ח ו מ צ ה פ ל ו ר ט י ת בשלב ה פ ע ל ת מ י ה ח מ צ ן ה א ל ק ל י י ם .
ה ב י ק ו ע נעשתה ב ש י ט ה ה צ י א נ ט .
התוצאות מ ם ו כ מ ו ה בטבלה מם'
ת ע ר ו ב ת של '5 :ט ב ל ה מם
.5
WH2־Ac-Cys-TyT-0-N-Gbz-S-IKP
ו
חומצה
N-Cbz-S-DNP-Cys-Leu-OH
־
א'
ב׳
ג׳
לויצין
62%
65%
58%
טירוזין
3%
25%
19%
גליצין*
36%
40%
32%
אלנין*
11%
8%
14%
אמינית טרמינליה
א.
ללא ה ג נ ה על ה ט י ר ו ז י ן .
ב.
ב נ ו כ ה ו ה ע ו ד ף פ נ ו ל בשלב מ ס י
ג.
ב נ ו כ ח ו ח ע ו ד ף ח ו מ צ ה פ ל ו ר ט י ת בשלב מ ס י
*
הופעה ג ל י צ י ן
ואלנין
.4
.4
נ י ד ו נ ה ל ה ל ן ב ס ע י ף III
.
״ 55־
ב ד ו מ ה ל כ ך ב ק ע נ ו - Nא צ ט י ל — - Sד י נ י ט ר ו פ נ י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה ,כאשר ש ל ב מ ם ' ) 4ה פ ע ל ת
חמצן
מי
מסי
(8
אלקליים( מבוצע ב נ ו כ ח ו ת עודף )פי
ניתן להסיק כי
)או - Nה י ד ר ו כ ס י -פ י ר ו ב י ל י ו ת ( אכן
ז ו על י ד י
נוכחות תרכבות
ציםטאין-טירוזין
ב ק ו ע קשרי
ב נ י צ ו ל ת של
פנוליות דמויות טירוזין.
בריבונוקליאזה.
כמו כן
°
נ י ת ן ה י ה ל א מ ת ב ד ר ך ז ו את ק י ו ם
ב י ק ו ע ט ד י פ ט י של
- Nפ י ר ו ב י ל על י ד י
( - oק ט ו
ריאגנטים
0
||
(
^
I
N
3
//
^ N H - C
<
נוקליאופיליים
ומאפשרים התקפה
נוקליאופילית
ד י ק ס ו ן ),(147
נוהה לכך.
I
H C
,
S
ל מ נ ו ע באופן חלקי
נ ו ק ל י א ו פ י ל י ה ס מ ו כ ה הנמצאה בעמדה
10,5
+
הריסה
- '2 ,2ד י א מ י נ ו -ד י פ נ י ל -א מ י ן
pH
NHR
-Nפירוביליות
.(76
)עמי
קבוצה
7
ניתוק
ניחן
קבוצות
את ק י ו ם קשר ז ה א י מ ת נ ו ג ם ע ל י ד י
ר י א ג נ ט י ם א ל ה י ו צ ר י ם ב ס י ס י ש י ף עם ה ק ב ו צ ה
ה -ן ן -פ י ר ו ב י ל י על י ד י
<
אלקליים לצורך
טירוזין ,וכי
ב ס פ ר ו ת מ ס פ ר מ ק ר י ם ב ה ם נ ב ק ע ו קשרי
ביפונקציונליים,
,
פוגעת בשיירי
א -פ י ר ו ב י ל על י ד י
ידועים
N
הפעלת מי חמצן
- sאמינואתיל-ריבונוקליאזה
^־אצטיל-
של הקשר
.10$
בהעדר פ נ ו ל לא
טירוזין.
מממצאים אלה
.2
פנול.
נמצאו כל שמונה התומצות ה צ פ ו י ו ת ,לרבות ט י ר ו ז י ן
נמצא כלל
הקשר
(100
ב א נ ל י ז ת -ק צ ה של ת ו צ ר י ה ב י ק ו ע ) ט ב ל ה
I
X
V
.
X
NHB
H-
>—/0
HC,
3
%
׳
0
//
0
X
H NNH-C
NH
2
2
NH
2
X
)(XXVIII
HC
\3
C
CO
׳
NR״H
+
y
2
N
=
2
\
NH
>ד0 /
\\>NHR
C
\
H C
\ 3
C
—
/
^C
^ N
NH,
2
v
— N
y
N
\
X
^ C-C
56-־
פצ׳ורניק וסוקולובסקי ) (107בקעי N
(XXIX7,100°
)-oפנילז־דיאמין
-פירוביל-גליצין בנזיל אםטר בניצולת של 30%
, p H - oלמשך שעה.
NHRH
/
-1C
\
)(XXIX
ד י ק ם ו ן )(174
ב 37°-ב ח ו מ צ ת ה ו פ ץ
ב י ק ע בעזרת ר י א ג נ ט זה
N
0.017ל מ ש ך
2
N
-פ י ר ו ב י ל -ג ל י צ י ן ב נ י צ ו ל ת ש ל 6 0 %ע ל ידי
2שעות.
ה ו א נ י ס ה לשפר א ת יעילות הריאקציה על
י ד י ה ו ס פ ה מ ה מ י ר י ם ש ו נ י ם ל ע מ ד ה מ ם ׳ 4ש ל ה ט ב ע ת הפנילן
כגון מתיל ומתוקםי ל א הגדילו
אלקטרונים
כגון ניטרו
-דיאמינית.
בהרבה א מ נ י צ ו ל ו ת ההיתוך ),(148
קבוצוה ד ו ת ו ת אלקטרונים
בעוד שקבוצות מ ו ש כ ו ת
ו ק ר ב ו כ ם י ה ו ר י ד ו ה ) ,(175כ נ ר א ה ע ק ב ה ו ר ד ה ה נ ו ק ל י א ו פ י ל י ו ת ש ל ה ק ב ו צ ה
האמינית.
ב ע ק ב ו ת ה צ ע ה ש ל דייר ר .ב .ו ו ד ו ו ר ד בדקנו א ת ה ר י א ק צ י ה ב י ן
-ד י א פ י נ ו -ד י פ נ י ל -א פ י ן ) ) ( XXXI
ובין
הנוקליאופיל
היתה
שקבוצת נוקליאופילית שלישית תסיע לביקוע הקשר ה -
הכנה
ה ה ר י -פ ו נ ק צ י ו נ ל י 2 ,2׳
ותכונות ש ל
DADPA
DADPA
הוכן לפי
ה ם כ י פ ה הבאה:
תרכבות
^פירוביליות
(DADPA
^ פ י ר ו ב י ל י )ראה להלן(.
ההנהה
57 -־
NaoCO'CuCl,180
11
| 2/Pd-C
)(XXXI
החומר אינו יציב במצב הופשי ונומה להתהמצן ולהשהיר ,אולם בתוך דיהידרוכלוריד הוא
יציב יותר.
המשקל האקויולנטי של התרככות הוא ,100לפי טיטרציה עם תומצה פרכלורית ומכאן
שרק שתי הקבוצות האמיניוה הראשוניות ניתנות לטיטור.
מימצא זה אושר בעזרת שיטה חדשה לקביעת
"השקול המימני" של בסיסים אורגניים ,המבוססת על צירוף של טיטרציה עם הומצה אורגנית הזקה
וםפקטרוםקופית n.m.r.
,כמות מסויימת של הבסיס האורגני )במקרה זה -
כלורופורם על ידי חומצה מתן-סולפונית בנוכחות מתיל-אדום כאינדיקטור.
והומםה ב. 0D -
2
הספקטרום ׳
0
'
DAEPA
( טוטרה בתמיסת
לאחר הופעת נקודת המעבר
ל חחמיםח מופיע בציור מ ם . 9
הסיגנל ^ 3.6ppmהוא של מימני המתיל של הומצה מתן-םולפונית ,והםיגנל ב ppm7.0 - 7.5-הוא
של המימנים הארומטיים של הבסיס.
יהס שטחי הסיגנלים הוא ,8 : 6.1ומכאן שנוסתת תוצר הטיטרציה היא:
יצויין שבשיטת "טיטרציה" זו אין השיבוה למשקל הבסיס הפטוטר ולרכוז הההומצה המטטרת.
- 58 -
a
6
o
a
ט
a
b
6-3
ro
o
x
u
a
(מ
sT
ml
a
1
—j
Ul
b
ט
ט
־0
•ס
Z
u
b
o
IS
w
59 -־
ניתוק קבוצות - Nפירוביליות על ידי
DADPA
( m Mבחמיסת חומצת חומץ
( n i M ) DADPAעל **־פירובילגליצין ) 1 0
ב 40%-אתנול ל—5י דקוה ב 25°-הביאה לשתרור גליצין בניצולת של .67%
תלות ניצולת הריאקציה בזמן ובטמפרטורה.
0.3
N
ציור מם׳ 10מראה את
העלאה הטמפרטורה ל 50°-או הארכת משך הריאקציה
לשעתיים העלו את ניצולת הריאקציה ב.10 - 20%-
כדי למצוא את תנאי הpH -
האופטימליים של הריאקציה ,ניבדקה ניצולתה בכופרים שונים,
טבלה מם' 6מראה את תלות ניצולת הריאקציה ב.pH -
טבלה מס׳ ;6
השפעת ה pH -על ניצולת החיתוך של פירוביל-גליצין
PH
ניצולת התיתוך
) %גליצין(
מ מ ם
הומצה הומץ
0.3 M
78
3.6
נהרן אצטט
0.1 M
81
5.0
נהרן אצטט
0.1 M
63
6.0
נתרן פוספט
005 M־
36
8.1
נתרן ביקרבונט
0.1 M
0
3.0
הטבלה מראה כי הpH -
האופטימלי הוא .3 - 3.6
ב pH -בסיסי אין התיתוך יוצא לפועל.
כמו כן בדקנו אה השפעת היהם המולרי של המגיבים על ניצולת הריאקציה.
מראה את תלות ניצולת ההיתוך ביהם המולרי של
DADPAל- N -פירוביל-גליצין.
ציור מם' 11
העקומה מראה
שהעלאת כמות ה^< DADPA -נבר ליהם מולרי של 1.5אינה מעלה יותר את ניצולת הריאקציה.
60-־
,
ציור מס 810
בתפיסת חי»ז חופז-40$ב0.3N
ביקוע -Nמידוביל-גליצין על ידי DADPA
א-מירוביל-גליצין וmM18DADPA -
תערובת הריאקציה הכילה 10 niM
. I ( 2 5 °;)II)5
0
°
אתנול״ )
% Cleavage
6 2 -־
הריאקציה
ב ו צ ע ה עם
את ת ו צ א ו ה ה ה י ת ו ך של פ ס פ ר
0.3
N
טבלת
א -פ י ר ו ב י ל -פ פ ט י ד י ם אחרים ,באוהם ת נ א י ם .
א -פ י ר ו ב י ל פ פ ט י ד י ם על י ד י
פס
,
;7
^ -פ י ר ו ב י ל פפטידים
בקוע
פ
ט
פ
י
ד
אהוז
- Nפירוביל-גליצין
- Nפירוביל-גליצין-בנזזיל
אםטר
- Nפירוביל-אלנין
N
-פירוביל-גליציל-גליצין
הביקוע
80
גליצין
78
גליצין
72
אלנין
78
גליציל
ב נ ז י ל אפטר
-גליצין
ה ר י א ק צ י ו ה של
DADPAעם ה ת ר כ ו ב ו ת ה פ י ר ו ב י ל י ו ח שקעה פ ה ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ת ר כ ו ב ת
א נ ל י ז ה אלפנטרית הפתאיפה ל נ ו ס ח ה
בספקטרום
פידובית־
בשתי
הוצר
הביקוע
תוצר ה ר י א ק צ י ה והצעת ם נ ג נ ו ג ה
בכל
בעלת
למשך שעה ב ה פ י ם ת
תופצת חופץ־
ה
זיהוי
DADPA
ב,50^-
טבלה פסי 7פראה
האינפרא-אדום
ובנדידה הכרופטוגרפית(
תרכובת בעלת נ ו ס ח ה א פ פ י ד י ת ז ו
דרכים הפםוכפוה
C^H^N^O־
ב ס כ י מ ה הבאה?
תרכובת זו
היתה זהה
להוצר הריאקציה שבין
יכולה להיוצד מ-
DADPA
) ב נ ק ו ד ת ההתכה,
DADPA
והקבוצה ה-
ו ב י ן הופצה
^-פירוביליה
- 63 -
CH, 0
V
II
C - C - NHR
NH2.״
5
C-C
N
2
NH H N H
2
)(XXXII
)(XXXI
0
CH
\ OH
CJ^NHR
CH, I
I
y^C-NHR
2
NH
3
HN—C
2
3
N
C NH
)(XXXIII
)(XXXV
1
- HNR
2
C H OH
3
)(XXXVI
)(XXXIV
התרככות
תוצר
א.
XXXIVו -
הריאקציה זוהה כ -
XXXVIה ן
איזומריות,
XXXVIע ל פ י ה מ מ צ א י ם ה ב א י ם :
ה ס פ ק ט ר ו ם ה א י נ פ ר א -א ד ו ם הראה פ ס ב ל י ע ה ב 1 6 9 0 ~ ^ -
להצביע הן על קבוצה ק ר ב ו נ י ל י ת
),(150
18
0םינתזנו
ובעלות הנוסחה
. C^H^^O
מבנה
)בנוסחה
אשר שלשת ח מ צ נ י ה ס ו מ נ ו
קודם ל כ ן
o
(XXXVIו ה ן ע ל ק ב ו צ ה
א ת ה ת ר כ ו ב תg ^ H ^ N ^ O(42$
8
m
.
ו
ב 0 -ע״י
8
1
אזומתינית
( על י ד י הגבת
ריאקציה-ההלפה
הואיל ופס זה
עם
יכול
)בנוסהה
DADPAעם ה ו מ צ ה
8
1
0 H(151
2
( .
(XXXIV
פירוביח
(
- 64 -
ספקטרום אינפרא-אדום ברזולוציה גבוהה של התרכובת הפםומנת הראה על תזוזה של פס
1
הבליעה מ~ -ה 1694 01ל—. c m1682
1-
תזוזה איזוטופית זו מורה על נוכתות קבוצת ^ =0ס
ו
אמידית ).(152
ב.
םפקטרום-מםה של התרכובת )ציור מסי ,12למעלה( מראה פסים חזקים המתאימים ליון
המולקולרי )=251
,(m/וכן לשברים הנוצרים מניהוק קבוצה מתילית ) ,( m/e =236קבוצה
e
קרבונילית ) ( m/e =223וניתוק שתי הקבוצות גם יהד ).( m/e = 208
הסימון האיזוטופי ב-
0
איפשר לזהות בספקטרום המסות של התרכובת המסומנת )ציור פסי ,12למטה( את הפרגנמטים המכילים
הםצן ,שכן רק פםיהם צריכים להופיע כדובלטים בעלי מירוות של שתי יתידות מסה.
דובלטים כאלה רק ביון המולקולרי ובפרגמנט . M- 15
הספקטרום מראה
מכאן שהשבירה הראשונית היא של הקבוצה
המתילית ,ובמקביל לכך ניהק ההמצן מהמולקולה בתוך קבוצת .( M - 28) CO
ג.
n.m.r.של התרכובה )ציור מם' (13מראה פס ^ 1 . 5 8
ספקטרום
סיגנל זה עשוי להתאים לקבוצה מתילית הנמצאת בעמדה
קרבונילית ולשתי קבוצות אמיניות ).(153
)2.35פראה סיגנל בשדה יותר נפוך
ppm
לפחמן רווי ,ובעמדה &ן לקבוצה
לעומת זאת קבוצה מתיליה הקשורה לקבוצה אזומתיניה
, ( p p mכפי שמצאנו בספקטרום של
ד .ח מ ו ם התרכובת ל 150°-במשך 10שעות בנוכתות
ניתן לצפות שבתנאים אלה תעבור התרכובת
לסינגלט(,
CBy-Hun^rro־N)=3Ph-C(CH
05Pלא גרם לשנוי בתכונותיה.
2
XXXIVדהידרטציה ,שכן היא מכילה קבוצה הידרוכםילית
שלישונית הסמוכה לאמין שניוני.
על סמך ממצאים אלה זוהה איפא הוצר הריאקציה כבעל המבנה
J - quinoxaline-£
, XXXVIז־א.
5,7 d i h y d r o - 6 a - m e t h y l o n e - 6 - c
ראיות מסיעות למבנה מערכת טטרה-ציקלית זו נתקבלו מבדיקת תכונותיהן של מספר תרכבוה
אנלוגיות מהסוג
ל התרכובת
ולדי
XXXVII
(.
XXXVIIשםונתזו על ידי הגבת
בעלת R = Hמראה ב-
n.m.r.
DADPAעם חומצות >נ>־קטו שונות
סיגנל ב-
5.50
.RCOCOOH
)ציור מם׳
ppm
(2NR0CHC )N2
2
6-־
־65 -
Abundance
(%)
-
5
להראות סיגנל ב-
בערך.ppm
66
-
לעומת זה מימן הקשור לפתםן בלתי רווי של קבוצה אזומתינית
טית )למשל במערכות פוריניות( מראה סיגנל באזור
(155
7.5
על סמך מבנה תוצר הריאקציה בין DADPA
< XXXII
XXXIמתקדמת לפי השלבים
ניתן להסביר את הריאקטיביות היותר גבוהה של
<
-
m
8.0
p
p
(
.
והקבוצה הפירובילית יש להניח כי הריאקציה
4XXXVI
XXXV
DADPAלעומת ם-פנילן-דיאמין בבקוע הקברצה
«
•
3
הפירובילית ,בקיומו של תוצר הביניים
, XXXV
בתרכובת זו נמצאת הקבוצה האמינית הראשונית
בעמדה נוהה מאד להתקפה נוקליאופילית על הקרבוניל הפירובילי.
תיתכן בתוצר הביניים
XXXאיזומריזציה של הקשר הכפול
עם פנילן-דיאמין לעומת זאת,
C=Nוהנוקליאופיל האמיני עלול
איפא להימצא בעמדת התקפה פחות נוחה.
השימוש ב DADPA -בביקוע פפטידי
כדי לבדוק את יעילות
-8דיניטרופניל-ציסטאיז
DADPAבביקוע קבוצות - Nפירוביליות או
- Nהידרוכסי-
פירוביליות הנוצרות בבקוע שיירי ציסטאין ,נבקעו מספר פפטדי - Sדיניטרופניל-ציסטאין.
ה לנגזרות דהידרואלנין נעשתה על ידי הפעלת תמיסה נחרן מחילט
ש
0.1למשך חצי
ע
ה
N
.
ניצולת האלימינציה הי הוד 93 - 98$לפי קביעה ספקטרוסקופיה של יון הדיניטרו-תיופנולט
ב -גןש
)
.(104420
שיירי הדיהידרואלנין נבקעו על ידי הידרוליזה )הרתחה למשך שעה (pH-n2
או על ידי חמצון )עם תומצה פרפורמית ב ,0°-מלווה בהעלאת ה pH -ל— 11למשך 15דקות( .הקבוצות
הפירוביליות או ההידרוכםי פירוביליות נותקו מתוצרי הביקוע על ידי הפעלת
החומצוה האמיניות שנהשפו על ידי כך ,נקבעו באלקטרפורזה )
מסוכמות בטבלה מס׳ .8
6.5pH3.5
DADPAב-
או
3-3.5
(.
. p H
תוצאות הביקוע
69-־
טבלה פסי :8
ביקוע פפטידי
- Sדיניטרופניל-ציםטאין
י
השייר האמיני
המשתחרר
ה
פ
פ
ט
ד
^קרבובנזו קםי - S -דיניטרופניל-
ציםטאיניל-לויצין-8די ניטרופניל-גלוטתיו ן
^קרבובנזוקסי- S-דיניטרופניל-
-ציםטאיניל-טירוזין-אפיד
*
שיטת הביקוע*
א׳
ב׳
לויצין
55%
61%
גליצין**
71%
64%
טירוזין אמיד
23%
15%
למשך שעה מלווה בהפעלת
pH
2
שיטה הביקוע :א׳ הידרוליזה על ידי הרתחה ב-
.
DADPA3.5
ב׳ המצוץ פרפורפי ,העלאת pHל— 11והפעלת
בpH3-־
DADPA
** נמצאה גם חומצה גלוטמית בשעור ,20 - 35%כנראה כתוצאה מביקוע בלתי םפיציפי.
3״ שיטה להפרדה וקביעה אוטומטית של
- Nפירוביל פפטידים
^פירוביל גליצין ,על אף היותו הסר קבוצה אמינית חופשית נותן תגובה נינהידרין
תיובית בתנאי הקביעה הפוטומטרית של תומצות אמיניות ,לפי שיטת מור ושטי\ן ).(156
בשיטה
זו מרחיחים את החומצה האמינית למשך 15דקות עם ריאגנט נינהידריני המורכב מ 2%-ניניהידדין
0־ -3%הידרינדנטין בתוך תערובת ) (1 : 3מתיל צלוםולב -בופר נתרן אצטט
4,pH5.5
N
.
ריאקציה הצבע של ^-פירוביל-גליצין מקימת אה תוק בר-לפבר ועוצמת הצבע הנינהרידיני היא
0.91פזו של גליצין )ציור מסי »(15תרכבות
)טבלה פסי .(9
- Nפירוביליות אחרות מתנהגוה באופן דומה.
- 70 -
ציור מסי ;15
)(1
תלות עצמת הצבע הנינהידריני ברכוז גליצין
,(11תנאי הריאקציה הם
ו-ן-1פירוביל-גליצין )
כבשיטת מור ושטיין )) (156די עמי .(100
־ 71־
טבלה מם־* ;9
התרכובת
*
עצמת הצבע הנינהידריגי של תרכובות
האמיניות החופשית
ה- N -פירובילית
^-פירוביליוח ביתם לזו של התרכובת
יהס עצמות הצבע הנינהידדיני*
N-Pyr-Gly-OH/Gly-OH
0,91
N-Pyr-Gly-OBz/Gly-OBz
0.84
N-Pyr-Ala-OH/Ala^OH
0.78
N-Pyr-Gly-Gly-OH/Gly-Gly-OH
0.82
הריאקציות הנינהידריניות נעשו בשיטת מור ושטיין ).(156
כאשר מבצעים את הריאקציה הנינהידרינית על ניר כרומטוגרפיה ,על ידי טבילת הניר,
בתמיסת 0.5$נינהידרין באצטון המכיל 15$מים וחמום הניר למשך 20דקות ב.60 - 70°-
התרכובות ה -א-פירובליות נותנות תגובה חיובית.
אין
מקרגור וקרפנטר ) (146מצאו תופעה דומה
עם - Nפירוביל לויצין ו-א-(^-קטו-איזוקפרואיל-אלניל-ולין.
במכשיר האוטומטי לאנליזה תומצות אמיניות )
( Amino acid analyserנקבעות
החומצות אמיניות לאחר הפרדתן הכרומטוגרפיח ,על ידי חמום עם ריאגנט נינהידרין
דומה לנ״ל אלא שהחומר הםהזר הוא לא הידרינדטגין אלא
תרכבות
^פירוביליות תגובה חיובית.
. SnCl
2
ג
״
בעל הרכב
ם בתנאים אלה נותנוח
על יסוד זה ניהן להפריד ולקבוע באופן אוטומטי
^ פ י ר ו ב י ל חומצות אמיניות או ^•פירוביל פפטידים בנוכהוה החומצוה האמיניות והפפטידים
ההפשיים ,ציור מם' 16מראה את ההפרדה הכרומטוגרפית של תערובת גליצין ו -א־־פירוביל
גליצין על הקולונה הקצרה )6
-
0.9
x
ם״מ,
IR- 120
( Amberliteשל המכשיר ,בבופר נהרן
באופן דומה ניתן היה להפריד אלנין מ- N .פירובילאלנין ,וגליציל
גליצין מ^ -פירוביל-גליציל-גליצין.
השתמשו.ו בשיטה זו כדי לעקוב אחר הריאקציה בין
הרבבות ^פירוביליות ו , DADPA -ואחר הטרנם»:מינציה של אלניל-פפטידים לנגזרות
).(161
-Nפירוביליות.
הפרדת - Nפירוביל-גליצין פגליצין על הקולונה הקצרה
ציור פסי 816
25
Spinco Amino Acidב-
) 6 x 9״ 0ם״פ( של Analyser
3־.pH
-
.III
.1
ח ת ו ך קשרי
-
73
ציסטאיניל בחלבונים
ריבונוקליאזה
זה מכיל 4ש י י ר י
חלבון
ידי
צ י ס ט י ן ,אשר על
ה י ד ו ר ם מתקבלים שמונה ש י י ר י
מתוך 124ש י י ר י ההומצות ה א מ י נ י ו ת המרכיבות את מולקולה ה ח ל ב ו ן .
הסמוכות
ל ש י י ר י הציסטאין ה ן :
טירוזין
א ר ג י נ י ן ך• ,85
־־ , 7 3
אםפרגין
אלנין
,2796 -
ליזין
-
,41
החומצות ה א מ י נ י ו ה
םרין
והומצה גלוטמית -
ציםטאין
,59 -
.111
,66 -
ליזין
)המספרים מ צ י י נ י ם את
עמדות ה ש י י ר י ם במולקולה ה פ פ ט י ד י ת ( .
כדי
של ש י י ר י
ההלבון
ע״י
בתמיסה
M8
למנוע
ל י ז י ן עם ש י י ר י
א נ ה י ד ר י ד אצםי
קליאזה,
אוריאה,
ב 0 ° - p Hבנוכהוה
^אצטיל-
H
8.6
p
י ד י אצטון
8
,
םפקטרוםקופית(
ולהיוצרות
הפעלת
0.1
ל— 11למשך 15דקוה והפעלת עודף
ה ק י צ ו נ י ו ת אשר
נוצרו
ה ב י ק ו ע של
בתפיסת תריאתילאפין
הי זו ר עם מרקפטואהנול
פלורודיניטרובנזן
N NaOH
7.3שיירי
1
ד ה י ד ר ו א ל נ י ן ) 91%מהערך
,שעתיים
ב
(
הפעלת הומצה פרפורמית למשך שעתיים ב , 0 ° -
DADPA
^אצטיל-ריבונו-
.
התיאורטי,
לפי קביעה
לפי קביעת הומצה
- 1 0 5 °ה ת ו צ ר נבקע בשתי
דרכים:
מ ל ו ו ה בהפעלת טי חמצן אלקליים ב נ ו כ ח ו ת
) (2הפעלת הומצה פרפורמית למשך שעתיים ב , 0 ° -העלאה ה -
ב 3 . 5 -
pH
ב 5 0 ° -למשך שעה.
בתהליך ה ב י ק ו ע נקבעו בשיטת הציאנט
).(128
- Nאצטיל8-
)עפ'
מם'8
. ( 40
pH
החומצות ה א מ י נ י ו ת
-פ י ק ר י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה נעשה באופן דומה לאהר
M0.1
ב5.5&-ך
.
למשך 30דקות גרמה
ד י נ י ט ר ו ת י ו פ נ ו ל ט ממול ה ל ב ו ן ) 96%מהערך ה ת י א ו ר ט י ,
שנוצרה ב ה י ד ר ו ל י ז ה תופצית ב NHC2-
פ נ ו ל ,למשך 45ד ק ו ת .
מהתוצר,
ידי
מ ל ו ו ה ה ד י נ י ט ר ו פ נ י ל צ י ה עם עודף
חומצי.
ל א ל י מ י נ צ י ה של
עודף
אוריאה.M
- 8ד י נ י ט ר ו פ נ י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה על
7 . 7קבוצות
)(1
ל י ז י נ ו א ל נ י ן על
ד ה י ד ר ו א ל נ י ן ה נ ו צ ר י ם בתהליך ה ב י ק ו ע ,נעשתה תחילה אצטילציה של
o־ 8
הוכן
וצר הושקע מתערובת הריאקציה על
פירוביה
יצירת שיירי
ידי
אינטראקציה של קבוצות ה -
- £אפינו
תו:צאות ה ב י ק ו ע י ם םםוכפוה בטבלה
אליפיניציה
.
74 -־־
מבלה מסי :8
תוצאות הביקוע על ריבונוקליאזה שעברה מודיפיקציה
ניצולת
חומצה אמינית
- Nטרמינלית
ליזין )*(66 ,41
ארגינין
)(85
אספרגין )****(27
)(59
םרין
הומצה גלוטמית )(111
אלנין
)***(96
טירוזין )(73
גלי צי ן ***
)מול/פול חלבון(
דיניטרופנילציה
פיקרילציה
א׳
ב׳
0.98
1.2
0.52
0.15
0.28
0.18
0.45
0.58
0.23
0.65
0.78
0.40
0.32
0.38
0.19
0.28
48־0
0.35
**0.10
0.32
**0.05
0.45
0.43
0.39
א' שלב 4של תהליך הביקוע נעשה על ידי הפעלת הומצה פרפורמית מלווה במי המצן אלקליים
בנוכחות עודף פנול־
ב' שלב 4של תהליך הביקוע נעשה על ידי הפעלת הומצה פרפורמית ,הבםםה
^ . p H
DADPA 3.5
*
^ 1 1
pH
והפעלת
המספרים בסוגריים מציינים את עמדות השיירים במולקולת החלבון.
** נמצא רק לאהד הגנה עם פנול בפני חמצון בשלב 4־
*** ערכי הגליצין והאלנין תוקנו עבור יצירה בלתי םפיציפית של חומצוח אלה על ידי הריאגנטים
המשמשים בשיטת הציאנט )ראה פרק די(.
**** נקבע בחומצה אםפרטית.
75 -־
הטבלה מראה שבחיתוך החלבון מופיעוה כל החומצות האמיניות הסמוכות לשיירי ציםטאין,
כמצופה בתוספת גליצין שהופעתו אינה צפויה לפי המבנה הראשוני הידוע של ריבונוקליאזה.
גם סוקולובםקי ופ׳צורניק (108) ,שביקעו ריבונוקליאזה בדיר דומה ,מצאו גליצין באנליזה קצה
של הוצרי הביקוע־
עובדה זו וכן העדר טירוזין )הנובע ,כאמור ,מתצון בשלב מסי (4הביאו
להעלאת האפשרות של קיום הקשר ציםטאיניל-גליצין במקום ציםטאיניל-טירוזין בריבונוקליאזה.
הממצאים הבאים מראים שהופעת הגליצין נובעת לא מקיום קשר ציםטאיניל-גליצין אלא משיטה
אנליזיה-הקצה־
א־
אנליזה-קצה איכותית של תוצרי הביקוע של ההלבון נעשתה בשיטת הדיניטרופנילציה ,לפי
המודיפיקציה של בורשטיין ) ,(157הפרקציה האתרית של הדיניטרופניל-תומצות-אמינו )המכילה
את החומצות הנייטרליות והתומציות( הופרדה בכדופטוגרפיה דו-מפדית על רובד דק )(158־
בכרופטוגרפיה הופיעו הנגזרות הדיניטרפניליות של חומצה אםפרטית ,חומצה גלוטמית ,םרין,
אלנין וטירוזין ,וכן כתם שהתאים לכאורה לדיניטרופניל-גליצין־
אבל בשלב השני של שיטה
בורשטיין )בו ממצים את הדיניטרופניל-חומצות-אמיניות ,וסאםטרים אותם עם דיאזומתן( לא
הופיע בכרומטוגרפיה הסופית כתם שהתאים לדיניטרופניל-גליצין מתיל אםטר ,בעוד ששאר
הדיניטרופניל-חומצות-אמינו הופיע כאםטרים מתיליים־
ב־
לאחר ביקוע תערובת הפפטידים ^קרבובנזוקםי-
-8דיניטרופניל-ציםטאיניל-טירוזין-אמיד
ו- N -קרבובנזוקםי-8-דיניטרופניל-ציםטאיניל-לויצין ,הופיע באנליזת-קצה של התוצרים בשיטת
הציאנט ,גליצין )ומעט אלנין( בנוסף לתומצות האמינו הצפויות )טבלה מם' (5־
)עמי
בניסיון אהר
(66שבו נקבעו תוצרי הביקוע של הפפטידים הנ״ל על ידי אלקטרופורזה וקביעה נינהידריניה
לא הופיעו הגליצין והאלנין המיותרים־
יש לציין שבאנליזה-קצה בשיטת הציאנט של תערובת-כיול
שהכילה פפטידים ללא גליצין ^טרמינילי ,לא הופיע גליצין מעבר לכמות הבלנק הנוצרת על ידי
הריאגנטים המשמשים בשיטה־
הופעה הגליצין קשורה איפוא )בדרך בלהי פוסברה( בצירוף של גורמים
התלויים הן בשיטת אנליזה הקצה והן בתנאי תהליך החיתוך־
- 76 -
העובדה שניתן למצא טירוזין קיצוני בתוצרי החיתוך של ריבונוקליאזה )על ידי הגנה
עם פנול בפני החמצון בשלב ,4או על ידי השימוש ב-
הגליצין אינה אלא
(DADPA־ וכן הממצאים הפראים שהופעת
, a r t i f a c tמאמתים את קיום הקשר ציסטאיניל-טירוזין בריבונוקליאזה.
את
קיום קשר זה הראנו גם בדרך אהרת ,על ידי בקוע טריפטי של - Nאצטיל-ריבונוקליאזה שעברה
- Sאמינואתילציה.
מטרת השימוש ב- N -אצטיל-ריבונוקליאזה היחה ,במקרה זה ,למנוע ביקוע
טריפטי של קשרי ליזין ,ולצמצמו לביקוע ארבעת קשרי הארגינין ושמונת קשרי - Sאמינואתיל-
ציםטאין בלבד.
^•אצטיל- S -אמינואתיל-ריבונוקליאזה הוכנה על ידי היזור
ריבונוקליאזה על ידי מרקפטואתנול בנוכחות
8
M
אמין ,לפי שיטת רפטרי וקול ).(121
שיירי
אתילציה(.
אוריאה ב-
8.6
- Nאצטיל-
, p Hמלווה בהפעלת אתילן-
אנליזת תומצות אמיניות של התוצר הראתה תכולה של 5.2־
- Sאמינואתיל-ציסטאין למול חלבון) ,ז.א 65$ .משיירי הצי-הציסטין עברו -8אמינו-
התוצר עוכל ב-
pH
7.5
עם טריפםין שעבר קודם לכן אינאקמיבציה חלקית עם
DPP
במטרה למנוע את פעילות הכימוטריפםין הנוכת בדרך כלל בתכשירי טריפםין )כימוטריפסין מגיב
עם
DPPבמהירות גדולה פי עשר מאשר טריפםין )((159״
לשם הבהנה בין תוצרי הביקוע של קשרי
ארגינין ובין אלו של קשרי - Sאמינואתיל-ציסטאין ,בוצע עיכול מריפטי גם על החלבון המחוזד
לפני האמינואתילציה.
אנליזות-קצה של תוצרי העיכולים הטריפםיים נעשתה בשיטת הציאנט ).(128
תוצאות האנליזות מסוכמות בטבלה מס׳ .9
מלבד התומצות ה-^ -טרמינליות המופיעות בטבלה
הופיעו גם כמויות קטנות ) 0.05 - 0.25מול/מול חלבון( של ולין ,מתיונין לויצין ואיזולויצין,
הנובעים כנראה מיתרת הפעילות הכימוטרופטית של תכשיר הטריפםין ,או כתוצאה מפעילות בלתי
ספציפית של הטדיפסין עצמו.
- 77 -
טבלה מם יי :9
אנליזת-קצה של תוצרי עיכולים טריפטיים של נגזרות ריבי נוקליאזה
חומצה אמינית
קיצונית
- Nאצטיל-ריבונוקליאזה
מחו זרה
תיאורטית
מול/מול
נמצא
מול/מול
^ א צ ט י ל -8 -אמינואתיל-
ריבונוקליאזה
ניצולת
תיאורטית
מול/מול
ניצולת
נמצא
מול/מול
%
2
1.1
55
1
0.55
55
3
2.1
70
0.35
ח' אםפרטית
1
0.43
סרין
0
0.21
חי גלוטמית
2
0.80
גליצין
0
0.31
0
אלנין
0
0.19
1
0.63
חצי-ציסטין
1
0.1
0
0
טירוזין
0
0
1
0.18
18
ליזין
0
0
1
0.1
10
ארגינין
0
0
1
0.05
5
43
40
10
63
הטבלה מראה שעיכול טריפטי לאחר אמינואתילציה גורם להופעת כל החומצות האמיניות הקיצוניות
הצפויות על פי המבנה הראשוני המקובל של דיבונוקליאזה ,לרבוח טירוזין ,שלא נמצא קודם על ידי
סוקולובםקי ופ׳צורניק ) (108שבקעו אף הם
^-אצטיל-8 -ריבונוקליאזה בדרך דומה.
)יצוין כי
םוקולובסקי ) (140מצא בין שאר החומצות האמיניות גם פניל-אלנין ) 0.2מול/מול חלבון( שלא נמצא
על ידינו־
ייתכן איפא שקרתה טעות בזיהוי הומצה אמינית זו ,שכן טירוזין ופנילאלנין מופיעוח
בסמוך זו לזו o־amino acid analyser
(.
הטבלה גם מראה שהופעת הגליצין שאף הוא נמצא על ידי
םוקולובסקי ופיצורניק ) (108אינה קשורה בשלב האמינואתילציה שכן גליצין מופיע בכמות דומה גם
לפני שלב זה.
כפי הנראה נובעת אף במקדה זו הופעת הגליצין משיטת אנליזת-הקצה.
התוצאות מאשרות
איפוא את קיום הקשר ציםטאיניל-טירוזין בריבו נוקליאזה ואינן הומכות בקיום הקשר ציסטאיניל-גליצין*.
*
לאהר בצוע עבודה זו פורסמה עבודה של פלפ ,רפטרי וקול ) (160בה אישרו בדרך דומה את קיום
הקשר ציםטאיניל-טירוזין בריבונוקליאזה־
- 78 -
-כימומריפסין
.2
המולקולה התלת-שרשהיה של *-01כימוטריפםין מכילה המישה שיירי ציםטין.
הראשוני של כיפוסריפסינוגןA(162
הקרבוכסילי( הן גליצין ,2 -
ליזין ,169 -
אלנין ,183 -
לפי המבנה
( התומצות האמיניות הסמוכות לשיירי חצי הציסטין )מהצד
גליצין ,43 -
גליצין ,59 -לויצין ,123 -
ליזין ,202 -
מתיונין ,192 -
.A
מציינים את עמדות השייריש בשרשה של כימוטריפםינוגן
) (162על ידי ניתוק הקשרים הפםטידיים בין השיירים ,13-14
וםרין .221 -
ה של הקבוצות האםיניות עם אנהידריד איצטי ב-
H
7-8
המספרים
זיםוגן זה הופך ל-0> -כימוטריפסין
146-147
,15-16
ביקוע (- 0כימוטריפםין נעשה בדרך דומה לזו של ריבונוקליאזה.
p
ולין ,137 -
8
,בנוכתות
ו.148-149-
ההילה נעשתה
M
אוריאה
)מטרה האצטילציה היהה לתסוס את הקבוצות ה04-־־אמיניות של ההלבון הטבעי וכן למנוע אינטר
אקציה של הקבוצות ה-& -אמיניוה של שיירי ליזין עם שיירי דהידרואלנין לאהר שלב האלימינציה.
אינטראקציה כזו חלה ב»( -ז -כימוטריפסינוגן לאחר אלימינציה של קבוצות דיסולפידיות באלקלי
לאהר היזור הוצר האצטילציה עם מרקפטואתנול ודיניטרופנילציה עם פלורודיניטרובנזן
).(125
הושקע החלבון באצטון חומצי.
אנליזת תומצות אמיניות )טבלה מסי ,(10מראה כי לא הל שינוי
ניכר בהרכב החומצות אמיניות ,ומכאן שההלבון שהתקבל הכיל את שלשת השרשרוה של
יופנולט למול חלבון
6
שיירי דהידרואלנין
2
.(N
0
.
9
)
.
ל
פ
9
ל
פ
*-c
י קביעה
י קביעה הומצה פירוביה לאהר הידדולינה
לאחר חמצון פרפורפי ב 0°-והפעלה מי תמצן אלקליים ב ,25°-נקבעו התומצות
האמיניות הקיצוניות שבתערובת הביקוע בשיטה הציאנט.
התוצאות מםוכמוה בטבלה מס׳ .11
הטבלה מראה כי ההומצוה האמיניות הצפויות הופיעו בניצולות של ) 33 - 68%על הניצולת הגבוהה
של סרין -ראה הסעיף "דיון"(.
מלבדן הופיעו כמויות קטנות של חריאונין וחומצה גלוטמיח,
וכמוה בלהי מבוטלה של הומצה אםפרטיה* .ייהכן שהופעהה נובעח מעיכול עצמי חלקי בהלבון הטבעי
של קשרי פנילאלנין 71 -או טירוזין .94 -
־79־
טבלה מ ס
,
:10
תומצות א מ י ג י ו ת
הרכב ח ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ח של כ י מ ו ט ר י פ ם י ז לאחר מ ו ד י פ י ק צ י ה
הלבו ן טבעי
8־דיניטרופניל-
א־אצטיל-
-כימוטריפםין
מם׳ ה ש י י ר י ם ל פ י
הםפרוח )(162
ליזין
13.6
13.4
14
היםטידין
1.9
2.0
2
ארגינין
3.5
3.5
3
חומצה אםפרטית
22.0
22.0
22
תריאונין
22.9
23.3
22
סרין
26.6
27.5
27
חומצה ג ל ו ט מ י ת
13.5
13,5
15
פרולין
8.4
8.1
9
גליצין
24.3
24,0
23
אלנין
21.5
21.6
22
ולין
21.0
21.7
23
מחיונין
2.1
1.9
2
9
9.4
10
לויצין
18.2
17.6
19
טירוזין
3.6
3.5
4
פנילאלנין
5.7
5.8
6
אי ז ו ל ו י צ י ן
- 80 -
,
טבלה מס :11
אנליזה קבוצות קצה של תוצרי הביקוע
חומצה אפינית
קיצונית
מספד שיירים
תיאורטי
ש
ל
מספר שיירים
שהתקבלו
- Nאצטיל- S -דיניטרופניל-כימוטריפםיז
ניצולת
ליזין
2
0.63
34
הומצה אספרטית
0
27־0
-
תריאונין
0
0.05
-
1
0.68
68
חומצה גלוטמית
0
0.08
-
גליצין*
3
1.65
52
אלנין*
1
0.41
41
מתיונין
1
0.36
36
לויצין
1
0.33
33
טרי ן
*
ערכי חומצות אלה הוקנו עבור יצירה בלתי םפיציפית שלהן בשיטת הציאנט.
*
הופיע כמתיונין-םולפון ,עקב שלב החמצון הפרפורמי־
.3
%
תלביז וירום פוזאיקת הטבק ) .( TMV
וירום מוזאיקה הטבק פורכב פליבה של
KNAהפוקפת בעטיפה הלבוניה.
עטיפה חלבוניה
זו מורכבת ממולקולות שרשרתיות זחות בנות 158תופצות אפיניות כל אחת ,אשר הקיצונית שבהן
)סדין( תסומה בקבוצת אצטיל ).(163
שייר תריאונין )מס׳ .(28
השרשרת כוללת שייר ציסטאין אחד )מסי (27ובסמוך לו
-
טבלה
,
12
: o a
הומצה
- 81
ה ר כ ב ה ח ו מ צ ו ת ה א מ י ג י ו ת של ו ז ל ב י ז
אמינית
ח ל ב ו ן טבעי )לאחר
ה פ ר ד ת ( RNA
™V -לאחר הפרדה
לאחר
דיניטרופנילציה
ודיגימרופנילציה
מספר ה ש י י ר י ם
לפי הספרות
2.2
1.6
2
היסטידין
0
0
0
ארגינין
11
11
11
18.5
18.8
18
תריאונין
15.3
15.2
16
םרין
15.7
15.9
16
16.2
16.6
16
פרולין
7.6
8.2
8
גליצין
6.6
6.4
6
14.0
14.0
14
ולין
14
13.5
14
מתיונין
0
0
0
8.5
8.3
9
11.6
12
טירוזין
4.4
4.1
4
פנילאלנין
7.7
5־7
8
ליזין
חומצה
חומצה
אספרסית
גלוטמית
אלגי ן
איזולויצין
לויצין
12
)(163
- 82 -
^RNA-
ד כאגרגט על ידי דיאליזה ב-
של הוירוס הופרד מהחלבון על ידי חומצת תומץ 67%לפי שיטת פרנקל -קונרט
H
4.7והוםם
p
8
.
האמיניות של החלבון המנוקה מופיע בטבלה מם' .12
7
. p H - n
הרכב החומצוה
ההלבון הכיל 0.72של קבוצה תיאולית למול.
לפי קביעה םפקטרוםקופיה של הומצה - '5,5דיתיו-בים-2)-ניטרובנזואית( )) (165
בנוכחות M5גואנידיניום ברומידSH.-a).כנראהשחל חמצון תלקי של קבוצת
החלבון(.
-
H
p
5
,(DTNB
בההליך הפרדה
ל 1.3-מיקרומול חלבון נעשהה דיניטרופנילציה עם 0.1מילימול פלורו-דניטרובינזן
בנוכחוה
M
גואנידיניום ברומיד במשך שעה.
אנליזת תומצות אמיניוה של תוצר
הדיניטרופנילציה ,לאהד ניקוי בדיאליזה )טבלה מם' ,(12מראה כי לא חל שנוי ניכר בהרכב
ירידה של כתצי שייר בתכולה הליזין נובעה כנראה מדיניטרופנילציה הלקיה של קבוצת
ההלבון.
בהפעלהNNaOH0.1-
ה £ -א מ י נ ו של הומצה אמינית זו.
אלימינציה של יון דיניטרותיופנולט ,לפי קביעה ספקטרוסקופית )
היופנולט שהשתהרר היתה 0.64מול למול תלבון.
על התוצר ההלבוני הלה הוך 50דקות
.(408
m uב מ ו ת הדיניטרו-
תוצר האלימינציה נבקע על ידי חמצון פרפורמי
)שעתיים ב 0°-וליאופיליזציה( העלאת ^־ pHל 11-למשך 15דקוה והפעלת
DADPAבנוכתוה
M1.6תומצת ת ו פ ץ א נ ל י ז ה קצה בשיטת הדיניטרופנילציה הראתה בכרומטוגרפיה על רובד דק.
כתם יתיד של - Nדיניטרופניל-תדיאונין ) 0.3מול/מול( כמצופה.
rv״
ד
י י
ז
שיטה הביקוע של קשרי ציםטאין כוללת שלשה שלבים עיקריים:
הציסטאיני לשייר דהידרואלנין.
בי:
האמינית הקיצונית של תוצר הביקוע.
ביתרונותיהן ובחסדונותיהן.
ביקוע שייר הדהידחאלנין.
אי :הפיכת שייר
גי:
השיפה הקבוצה
להלן נדון באפשרויוה השונוה לבצוע כל שלב,
83 -
ש ל ב :'s
בקבוצה
הפיכת שייר הציסטאין
הבחירה
<^ -א ל י מ י נ צ י ה ,
הציםטאין
בקבוצה
0
^
2
9
pH
6
, p H
ו—, 13
-8)0 (N2H S
קבוצת ה
2
עוברת
אלימינציה
דיאקצית
קלוה הקישור לשייר ה צ י ס ט א י נ י ,
לנגזרת
8מתיל-ציסטאין
בעוד שקבוצוה ה S -
בההאמה.
יכולת
ה א ר י ל -ה ל י ד המהאים
S
-
-דימתיל-
בתנאים העלולים לגרום לריאקציות צדדיות
מאידך עוברת קבוצת ה S -
פ ו ר מ י ל צ י ה ).(107
יחסית
ה ת מ ר ה של ש י י ר
פ י ק ר י ל י ת יוצאת ל פ ו ע ל ב ק ל ו ת על י ד י
נ ע ש י ת ב ה ו מ צ ה פ ו ר מ י ת במשך 24ש ע ו ת ,
f-N
אלימינציה ב -
1
ד י נ י ט ר ו פ נ י ל י ת או
או
קבוצת
הקבוצות היכולות
ד י מ ת י ל -ם ו ל פ ו נ י ו ם ).(107
ואפשרות המעקב ה נ ו ח אחר ר י א ק צ י ה ה א ל י מ י נ צ י ה .
ב ע ו ד ש ט ר צ י א ר י ז צ י ה של
םולפוניום
כגון
S
-דיניטרופניל,
s
-פיקדיל וכן
בקבוצה המתאימה ת ל ו י ה ב ת כ ו נ ו ת כ ג ו ן
לעבור
שחלוף
ל ד ה י ד ר ו א ל נ י ן ד ו ר ש ת התמרה של ה ק ב ו צ ה ה ת י א ו ל י ת
מ ו ש כ ת א ל ק ט ר ו נ י ם ש ת ו כ ל לשמש כ ק ב ו צ ה ע ו ז ב ת ב ר י א ק צ י ה ה א ל י מ י נ צ י ה .
לשמש ל מ ט ר ה ז ו ה ן
pH6ת ו ך 30ד ק ו ת ,
-
-פיקריל ו S -
-דימתיל-סולפוניום
דיניטרופניל עוברות אלימינציה
מ כ א ן ש ס ד ר ה מ ש י כ ה ה א ל ק ט ר ו נ י ת ה ק ו ב ע את ר י כ ו ז ה א ל ק ל י ה ד ר ו ש
^SMe2.־>SCgHLjtNO
3
-
ד
נ
י
י
ט
ר
ו
פ
ב נ י צ ו ל ו ת ג ב ו ה ו ת ) 90$ו מ ע ל ה ( ,ת ו ך א פ ש ר ו ה מ ע ק ב ס פ ק מ ר ו ם ק ו פ י נ ו ה
ל ו א י אפשרית ה י א התמרה
השכן ,ת ו ך יצירת ה א ו ק ס ז ו ל י ן
'CHCQNHR
I
CH-OH
נ ו ק ל י א ו פ י ל י ת א י נ ט ר א מ ו ל ק ו ל ר י ת על י ד י
f־
R-C
'
OH
•
J
1
I
R —C
I
0 — CH-,
)ץ1ז!.(408
ה ק ר ב ו נ י ל האמידי
. XXXVIII
C H — C O — NHR
נ
י
ל
-
ריאקציה
כ ל ל ב10%-
בדרך
הניצולות
י כ ו ל ה ל ה ס ב י ר את ה ע ו ב ד ה ש נ י צ ו ל ו ת י צ י ר ת ש י י ר י
5 -מ נ י צ ו ל ה שהרור
ה ג ב ו ה ו ת של ה ו פ ע ת ס ד י ן
ה ב י ק ו ע של
בממצא
לואי
זו
ריבונוקליאזה
- 84
ו-
יון
הדיניטרוהיופנולט.
קיצוני
גלוטמיה
להומצה
האלימינציה
דרך
זו
)כ.(50%-
קומפלכס
על ידי
הפחמן
בתנאים אלה,
תריניטרובנזניוה
הקבוצה
להפוך
ביניים.
אמינים כגון
יהכן
יוצרים קומפלכםי
תרימתילאמין אינם
מ י י ז נ ה י י פ ר עם
ל י י נ ן את
ולגרום לאלימינציה.
- Sד נ ם י ל ה י ת ה ע ש ו י ה לשמש כ ק ב ו צ ה ע ו ז ב ה נ ו ה ה ה ו ד ו ה ל ה כ ו נ ו ה י ה ה פ ל ו א ו ר ם צ נ ט י ו ת ,
ציסטאין
לנגזרות
מכיימוטריפםין.
-8דנסיליוה
יציבות,
א ו ל ם ע ד כ ה לא ה ו ב ה ר ו
וזאת
)עמי
בהצלהה
יצירה שייר ציםטין
(43אה ה ע ו ב ד ה ש ה ר ט ל י
והומצה
) (133ה צ ל י ה ל ה כ י ן
- Sד נ ם י ל י ת י צ י ב ה ,שכן
)כגון
הסיכויים לריאקצית לואי
ה ל ב ו ן ה ( TM7 -אפשר
-1
- Sדנםיל-
א ו ל י ל ה ס ב י ר ב כ ך ש נ ו כ ח ו ת ה ק ב ו צ ה ה ק ר ב ו כ ס י ל י ת ה ש ל י ל י ה מ ו נ ע ת ה ת ק פ ה של
י י ת כ ן ש ב ה ל ב ו נ י ם ב ע ל י ש י י ר צ י ם ט א י נ י אהד
הנםיונות
pyב ר י א ק צ י ה ה ל ו א י שבה מגיבוז ,ק ב ו צ ה
נ ו ס פ ת עם ה ו צ ר ה ב י נ י י ם ה - S -ד נ ם י ל י ה מ ש ו ע ר ה ו ך
ציסטאין-ניתן
נגזרת
)עמי
.( 38
ואפשר
יהיה למנוע ריאקציה לואי
) (166מ א י ד ך הם ע ש ו י י ם ל פ ע ו ל כ ב ס י ס י ם מ ס פ י ק ת ז ק י ם כ ד י
דימהילאמינו-נפתלן-5-סולפיניה
התיאולט.
ב נ י צ ו ל ו ת ה נ מ ו כ ו ת י ח ס י ת של
נ ו ב ע ת מ ק י ו מ ה של ר י א ק צ י ה ל ו א י שבה נ ו צ ר ת ח ו מ צ ה פ י ק ר י ת
ל א ל י מ י נ צ י ה של ק ב ו צ ת - 0ד נ ם י ל
שיירי
תיאולית
ה ו פ י ע ו פרט
מרין.
C0 -של ש י י ר ה 8 - -פ י ק ר י ל -צ י ס ט א י ן ,
באנלוגיה
ז ו יש
בצוע האלימינציה בעזרת בסיסים א מ י נ י י ם שלישוניים בתמיסות אלמימיות כ ג ו ן דימתיל-
םולפוקםיד.
הרכבות
מ י י ז נ ה י י פ ר כתוצר
( XXXVTב ת ו צ ר י
- Sדיניטרופניל-גלוטתיון
ה מ ד ו נ ה של ק ב ו צ ת ה - S -פ ר י ק ר י ל ב ת ו ר ק ב ו צ ה ע ו ז ב ת ה ו א
הסיבה לכך
ל ה ס ב י ר את
ר א י ה נ ו ס פ ה ל ק י ו מ ה של ר י א ק צ י ה ל ו א י
ש ב א נ ל י ז ה ת ו מ צ ו ת א מ י נ ו ת של ת ו צ ר ה א ל מ י נ צ י ה של
ו ג ל י צ י ן גם
כ ן יש ב כ ך כ ד י
) ה נ ו צ ר כנראה דרך ה א ו ק ס ז ו ל י ן
-0>.כימוטריפםין.
0.08ש י י ר י
כמו
דהידרואלנין
נמוכה
יון
יהיה לקבל
א י נ ט ר מ ו ל ק ו ל ר י ת ב מ ק ר ה ז ה הם ק ט נ י ם .
-
קבוצות
- 85
ד י ם ו ל פ י ד י ו ת של ש י י ר צ י ם ם י ן ע ו ב ר ו ת א ל י מ י נ צ י ה ב א ו ת ם ת נ א י ם )
ח ל ה א ל י מ י נ צ י ה של ק ב ו צ ת - 8ד י נ י ט ר ו פ נ י ל -צ י ס ט א י ן .
לשיירי
דיניטרופניל-ציסטאין
דהידרואלנין
ב ע י ת ה ה פ י כ ה ה ס ל ק ט י ב י ת של ש י י ר י
בנוכחוה שיירי
הדעת־
קבוצת
- 8ד י נ י ט ר ו פ נ י ל ,על י ד י ה ו ר ד ת ט מ פ ר ט ו ר ת ה ר י א ק צ י ה ם 2 5 ° -ל -
למנוע
הקבוצות
קבוצות
דיםולפיד
S
ה ש ו נ ה של י ו ן
תבוצע
השואה מ ה י ר ו ה ה ר י א ק צ י ה ב י ן
תיאולית )כ 10-דקות(
ב ש ע ו ר של כ 2 0 $ -ב ל ב ד .
S
פ ג ע ו ת במידה ז ו או אתרת ב ק ב ו צ ת ה -
יון
S
-
ריאקצית הםולפיטוליזה
הםולפיט וקבוצת
S
-
ב ת נ א י ם ז ה י ם מ ל מ ד ת כ י ב ז מ ן ה ד ר ו ש ל ם ו ל פ י ט ו ל י ז ה מ ל א ה של ק ב ו צ ת .ד י ס ו ל פ י ד ל ק ב ו צ ת
ולקבוצה
םולפיטוליזה
ה מ ו ד י פ י ק צ י ו ת של
) צ י ו ר י ם מ ס י 7ו ( 8 -עם מ ה י ר ו ת ה ס ו ל פ י ט ו ל י ז ה של ש י י ר י צ י ם ט י ן ש נ ח ק ר ה ע ל י ד י
)(145
-סולפו
י ה ס י ת ל ז ו של
אפשר ל מ נ ו ע את ה א ל י מ י נ צ י ה ע ל י ד י ה פ י כ ת
עם ז א ת מ ת ב ר ר כ י מ י ד ת פ ג י ע ו ה ה של ק ב ו צ ה ז ו ע ל י ד י
ב י ח ס לשאר ה מ ו ד י פ י ק צ י ו ת .
דיניטרופניל
ביילי
) ה י ז ו ר ,המצון
וסולפיטוליזה(
S
, 0 °אולם א י ן בכך כדי
ה ד י ם ו ל פ י ד י ו ת ל נ ג ז ר ו ת ט ע ו נ ו ת ש ל י ל י ת ,א ו ל ם מ צ א נ ו כ י שלשת ס ו ג י
דיניטרופניל.
קטנה
נ י ת ן ל ה ק ט י ן ב כ 6 0 $ -את מ י ד ת ה א ל י מ י נ צ י ה של ק ב ו צ ו ת ד י ם ו ל פ י ד
ה א ל י מ י נ צ י ה של ק ב ו צ ו ת ד י ם ו ל פ י ד ״
-
צ י ם ט י ן ,ט ר ם מצאה פ ת ר ו ן מ נ י ח את
ר א י נ ו כי
כ ל י ל את
13
( p Hבהם
עוברת קבוצת ה S -
)(145
הבדל זה ב מ ה י ר ו י ו ת ר י א ק צ י ו ת ה ס ו ל פ י ט ו ל י ז ה
הסולפיט כלפי
ד י נ י ט ר ו פ נ י ל סולניטוליזה) ה נ ו ב ע כנראה
מהנוקליאופיליות
ג פ ר י ת ו כ ל פ י פ ת מ ן ( מ ע ל ה את א פ ש ר ו ת ה מ ו ד י פ י ק צ י ה ה ב א ה :
מלאה על ה ק ב ו צ ו ת ה ד י ס ו ל פ י ד י ו ת ) ע ל י ד י מספר
מהזורי המצון
ב מ ק ו ם לבצע
וסולפיטוליזה תוזרת(
-ק ר ב ו כ ס י מ ת י ל צ י ה של ה ק ב ו צ ו ת ה ת י א ו ל י ו ת ה נ ו צ ר ו ת בשלב ה ר א ש ו ן של ה ם ו ל פ י ט ל י ז ה :
־-S״R
ICH C00
2
"RLS-CH -COO
2
R — S — SO" -tf
y
^2
'R - S - S - R
- 86 -
באופן זה תושג הפיכה של קבוצות הדיםולפיד לנגזרות טעונות שלילית שאינן עוברות
אלימינציה ,אם כי במהיר ירידה של כ 20%-בתכולת קבוצות ה- s -דיניטרופניל-ציסטאין.
שלב נ':
ביקוע שייר הדיהידרואלנין יכול להיעשוה בדרך הידרוליטיה )המום ב-
ל 100°-למשך שעה( הוך יצירה
2
pH
א-פירוביל פפטיד ,או בדרך מתמצנת )הפעלת הומצה פרפורפיה
ב 0°-למשך שעהיים מלווה בהעלאת ה pH -ל— (10 - 11תוך יצירת - Nהידרוכםיפירוביל פפטיד,
OH
I
1
A
~
RCGNH- + CH COCONHR
2
3
'RCO-NH-C-CO-NHR
I
_CH
'RCO-NH-C-CO-NHR
II
_CH
OH
I
•RCONH + H0CHC0C0NHR
2
2
• RCO-NH-C-CO-NHR
I
CH 0H
HCO^H
2
הסרון השיטה ההידרוליטית הוא ברגישות קשרי אםפרטיל להנאים אלה ).(83
כאשר הורתתה
Nאצטיל-דהידרוריבונוקליאזה pH2^-למשך שעה נתגלו הקבוצות האמיניות הקיצוניות הבאות
בשיטת הציאנט?
חומצה אספרטית ) 0,096מול למול חלבון( תריאונין ) ,(0,056סדין ),(0,012
חומצה גלוממיח ) ,(0.041גליצין ) ,0.094אלנין ) ,(0.071ולין ) ,(0.08בחלבוניפ יש איפוא
להעדיף את שיטח הביקוע חמחמצן ,אף כי היא כרוכח בהריסת שיירי טריפטופן,
שלב ג'»
רכיםז
ניתוק הקבוצה הפירובילית )או החידרוכסיפירובילית( יהול להיעשות אף
א .הפעלת מי חמצן אלקליים,
ב.
הפעלת
3
־0H
CHC00H + C0 + H NB
2
2
DADPA
^,pH
H202
3
'COCONHR
- 87 -
י ת ר ו נ ה של ש י ט ת מ י ה ח מ צ ן ה ו א ב פ ש ט ו ת ה
)נידיף(
לתנאי
ואמ עודף ה ר י א ג נ ם
החמצון.
)על ידי
כפי שהראנו
חומרים
בהנאיה
האלקליים החריפים יחסיה,
)(167
הריאקציה
)50$
כגון
טירוזין
ניצולות הריאקציה.
פ נ ו ל וחומצה פלורטית.
ב ש י ט ת ה DADPA -א י ן ח ס ר ו נ ו ת א ל ה ק י י מ י ם .
ליזינואלנין.
)- 65$
ניצולות
ה ד ר ו ש י ם ל ב י ק ו ע קשרי
כגון
ידי עיכול טדיפטי.
חקרגוכסיליות
במקדח זה ר צ ו י ל ח ס ו ם *
p
H
(
כי הפעלת חומצת מדמודמיח
ד ח י ד ד ו א ל נ י ן א י נ ה פ ו ג ע ת כ כ ו ש ר ת נ י ת ו ק ת ד ב ד ם י ב ל י של ח ק ג ו צ ח
ע ו ג ד ח ז ו ע ו ל ה כ ק נ ה א ח ד עס
ו פ ר א צ ט י ת ).(168
הליזין
בקבוצה אצילית
- Nפ ל א י ל ה נ י ת נ ת ל ה ו ר ד ה a־3 (18
כ ג ו ן חומצח פ ל א י ת וחומצח פ ו ם ר י ת ב פ נ י
פרבנזואית
.(50
ב ת ל ב ו נ י ם ה מ כ י ל י ם קשרי
חסימת ה ש י י ר י ם ה ל י ז י נ י י ם ע ל ו ל ה ל ח ו ו ת ח ס ר ו ן במקדה
בתרכובת הדגם חומצת - £ז ! -מ ל א י ל -א מ י נ ו -ק מ ר ו א י ת הראו
א-םלאילית,
רוויות
ציסםאין
ה ח י ת ו ך ,למשל על
את ת ש י י ר ח ל י ז י נ י ב ק ב ו צ ת ח ס י פ ח ד ג ר ס י כ ל י ת ,
ח-
ז ו הוא
ב נ י צ ו ל ו ת נ מ ו כ ו ת במקצת
יש ל ת ס ו ס ת ח י ל ה את ה ק ב ו צ ו ת ה - £ -א ם י נ י ו ת של ש י י ר י
של צ ו ר ך ב ב י ק ו ע נ ו ס ף של ת ו צ ר י
בתנאים
נ ו ס ף של ש י ט ה
ניכחית
ה ע ל ו ל י ם ל ג ר ו ם ל ר י א ק צ י ה צ י ק ל י ז צ י ה של ה ש י י ר ה ־ ן! -פ י ד ו ב י ל י
(30מאשר א ל ו ה מ ת ק ב ל ו ת ב ב י ק ו ע פ פ נ ז י ד י
לפנוע היווצרות שיירי
נסיונות
הסדין
ש ה ר א נ ו ש י ט ו ת ה ב י ק ו ע נ י ת נ ו ת לשמש ב ת ל ב ו נ י ם ,אם כ י
ציסטאיניל־ליזין
כדי
אולם חסרונה נעוץ ברגישות שיירי
ג ב ו ה ו ת ב ד ר ך כ ל ל בכ-־ 10$מ א ל ו שבשיטה מ י ה ח מ צ ן .
כפי
-
הטירוזין
נ י ת ן ל מ נ ו ע ב א פ ן ח ל ק י את ה ר י ס ת ש י י ר י ה ט י ר ו ז י ן על י ד י
פנוליים דמויי
ולהורדת
קטלזה(.
ו ב א פ ש ר ו ת ה ג י ה ה ל ס ל ק את ת ו צ ר י ה ר י א ק צ י ה
י צ י ב ו ת ם ה י ד ו ע ה של ח ו מ צ ו ת
(.ם־
ft
-בלתי
ת ו מ צ ו ת פ ר א ו ק ס י א ו ר ג נ י ו ת כ ג ו ן חומצה
י צ י ב ו ת ז ו מ ו ס ב ר ת ב א פ ק ט ה מ ש י כ ה ה א ל ק ט ר ו נ י ת של ה ק ב ו צ ו ת
ח ק ש ן ר ו ח י ש י ר ו ת לקשר ח כ פ ו ל ח א ח י ל נ י .
- 88 -
פרק
ג
,
ב ק ו ע קשרי - Nא צ י ל -צ י ם ם א י ן
בפרק א׳ ד א י נ ו כ י ה כ נ ס ת פהפן א ל ק ט ר ו פ י ל י לעמדה >Pשל השרשרת הצדדית על חומצה
אמינית,
ג ו ר מ ה ל א י נ ט ר א ק צ י ה עם ח נ ק ן הקשר ה - N -א מ י ד י ה מ ל ו ו ה ב ב ק ו ע קשר ז ה .
ל ר י א ק צ י ה מ ט י פ ו ס זה הם ב ק ו ע קשרי
ב ע ז ר ה פ ו ס ג ן ,ו ב ק ו ע קשרי
- Nאציל-םרין
) (66ו - N -א צ י ל -ח י ר א ו נ י ן
^ א צ י ל -צ י ס ט י ן בעזרה צ י א נ י ד
בפרק ?ה נתאר שיטה הדשה ל ב י ק ו ע קשרי
דוגמאות
)(68 ,67
).(69
- Nא צ י ל -צ י ס ט א י ן המבוססת על ע י ק ר ו ן ד ו מ ה .
שלבי השיטה מ ס ו כ מ י ם ל ה ל ן :
"R ' C O - N H — CH-COR
\
1
RCOC1
יR'CO-NH-CH-GOR
I
\
s
״CH
2
I
SH
0
)(XXXIX
pH 8
"R'CO-HN-—CH-COR
־+ R
/
OC
\
״CH
HN
"CH-COR
\
pH 8
x
2
׳S
.CH
/
/
\
OC
+
R'COoH
)(xxxx
בשלב א ׳ ע ו ב ד ה הקבוצה ה ת י א ו ל י ת א צ י ל צ י ה ת ו ך י צ י ר ת
התקפה על ה ה נ ק ן ה - N -א מ י ד י ת ו ך י צ י א ת ה א נ י ו ן ". R
של ה - 2 -ק ט ו - 3 -א צ י ל -ה י א ז ו ל י ד י ן
. XXXIX
בשלב ב ׳ הלה
בשלב ג ׳ הקבוצה ה - N -א צ י ל י ה
XXXXע ו ב ר ה ה י ד ר ו ל י ז ה .
- 89 -
השלבים
ל
ב'
ו -ג ׳ הם ר צ ו פ י ם
כלורו-פורמט
-
כלוריד
5
R = c H
י ו ד ו מ ט ד י ת ת ו ך 30ד ק ו ה
o־ 7
60$מ ח ו מ ר ה מ ו צ א .
- Nקרבובנזוקםי.
גליצין
הקבוצה התיאולית
ב ע ו ד ף פ י 3 - 5של ה ר י א ג נ ט .
ג ם ק ב ו צ ו ת ( - 0א מ י נ י ו ת ע ו ב ר ו ת
אתיל-אסטר באותם ת נ א י ם גרמה
ל פ י כ ך ב ו צ ע ה ר י א ק צ י ה ה ב י ק ו ע על
טריפפפטידים מ ו ג נ י ם בקבוצת
שיטח ה ב י ק ו ע ב ו צ ע ה כ ד ל ק מ ן :
ז*-קרבובנזוקםי-הריפפםידים
דיקרבונזוקסי
pH
ה ק ב ו צ ה ה ת י א ו ל י ת ,שכן
ת ל ק י ת ב א ו ת ם ת נ א י ם ,ל מ ש ל ,ה פ ע ל ת NPOCOClעל
ל א צ י ל צ י ה של
4
ציםטאיז
האצילציה אינה םלקטיבית לגבי
אצילציה
6
0
(
ופנילתיוקדבוניל
ב א צ י ל צ י ה של ג ל ו ט ת י ו ן עם NPOCOCl^ -PTCOCl -s-ה ר א ו כ י
א צ י ל צ י ה מלאה ל פ י ט י ט ר צ י ה
בדם,
N
H
ריאגנטי
(
ביקוע תריפפמידים מכילי
נםיונות
עוברת
C
()S)PTCOC1
6
א.
4
ו י ו צ א י ם לפועל באותם ת נ א י ם .
ה א צ י ל צ י ה ) ( RCOCl
ידי
ה מ ת א י מ ו ת על
מכילי-ציסטאין
תמיסת נתרן
הוכנו
מהנגזרות
in situ
הN-
-S,
מ ת ו ק ס י ד ).(170
11
Cbz-NHCHR R"C00י•CO-NHCHCO-NHCHR
^
NaOMe
MeOH
2
CH
Cbz־S
1
,
" COORי CO-NHCHCO-NHCHRי Cbz-NHCHR
I
CH.
2
I
SH
הקבוצות
וחאצילציח
ההידדוליזה
) 8 . 1
שלהן
ש ל ו ) ( ROHע ל
( p H
ח ת י א ו ל י ו ח עברו
נ ב ד ק ו על
ידי
ידי
א צ י ל צ י ה pH 3-7
טיטרציות
)בופד
יודומטריות.
פוספט(.
לאתר מ י צ ו י
א ת ר ,ה ו פ ע ל ה על ת ו צ ר ה ר י א ק צ י ה ת פ י ס ת
ב 5 0 ° -למשר 90ד ק ו ח .
בפרק
זפן
שחדור הקבוצות ה ת י א ו ל י ו ת
זה שוחרר ב א ו פ ן
עודף חדיאגנט ותוצר
0.1
כפותי
יון
M
ביקרבונט
ח נ י ט ר ו פ נ ו ל ט ,לפי
- 90 -
402
קביעה םפקטרוסקופיה )
.( X
! m i־
)בשלב זה ניתק הקשר בין שייר הציסטאין ובין
ה- N-קרבובנזוקםי -הופצה אפיניה הקיצו נ יה( .לאהר ההפצה ונידוף ,הופעל על ההומר הפסים
באחר ,מיפן ברופי בתופצת תופץ כדי לנתק את קבוצה ה^ -קרבובנזוקסי ).(171
על ידי כך
מהקבלה ההומצה האמיניה התופשית שהיתה קשורה קודם לכן לשייר הציסטאיני.
תוצאות הביקוע של פםפר פפטידי ציםטאין פופיעוה בטבלה מסי .13
מבלה מם' ;13
ביקוע קשרי - Nאציל ציסטאין בתריפפטידים
תוצר הביקוע**
ניצולת %
Cbz-Glu £ -Cys(SH)-Gly-0H
NP0C0C1
הופצה גלוטמית
30
-Cys (SH)-Gly-OHץ Cbz-Glu
FTC0C1
הומצה גלוטמיה
47
Cbz-Phe-Cys(SH)-Gly-OH
NP0C0C1
פנילאלנין
73
Cbz-Ala-Cys(SH)-Gly-NH
NP0C0C1
אלנין
53
Cbz-Ala-Cys(SH)Gly-OH
NP0C0C1
אלנין
50
פ
2
פ ט י
ד
ריאגנט האצילציה*
4-N0^C,H C0Cl = NP0C0C1
*
2 6 5
** נקבע בעזרה amino acid analyser
בתומצת הומץ.
r
C,H SCOCl = PTC0C1
5ם
לאחר הורדת קבוצת הקרבובנזוקםי עם מימן ברומי
r
ב .נםיונוה לביקוע ריבונזקליאזה
נםיונות לביקוע קשרי - Nאציל ציםטאין בריבונוקליאזה לא הוכתרו עד כה בהצלחה.
H
p
)
ש
ה
ו
ז
ד
ה ההילה
ע ם ' מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל 8Mבנוכתות( ,
אוריאה ,נהקבל ע״י השקעה באצטון הומצי הלבון שהכיל 19.2קבוצוה ניטרופניליוה קשורוה למול
ריבונוקליאזה ,כפי שנקבע על ידי כמוה הניטרופנול הנוצר בהידרוליזה אלקלית עם .0.2N NaOH
כדי לקבוע את תכולת שיירי הליזין החופשיים שבתוצר ,בוצעה דאמינציה עם נהרן ניטריט
בנוכחוח חומצוח חומץ.
לאהד דיאליזה והידדוליזה תומצית הראתה אנליזח חומצות אמיניות
- 91 -
הכילה של 10.2שיירי ליזין לפול הלבין.
הכילה לפי הידריליזה תומצית 2.3
ריבונוקליאזה טבעית שעברה דאמינציה בתנאים דומים
שיירי ליזין )פהיך 10שיירים היאירטיים(.
פכאן שלפהוה
8שיירי ליזין נחםפי בקביצית ניטרופנילאוקםיקרבוניל.
בהפעלת
M1
ביקרבינט על ניטריפנילאיקסיקרביניל-ריביניקליאזה ב -50°השתתרר תיך
שעה ניטרופנילט בניצילת של .93$
באנליזה
-0טרפינלית של התיצרה בשיטת ההידרזיניליזה
) (172לא נפצאה בניגוד לפציפה כל קבוצת קצה ,לרבית ילין שהיא הקביצה ה.-0 -תרפינלית של
ריבונוקליאזה טבעית ,ושניתן לזהוהה בהידרזינוליזה של ריבונוקליאזה טבעית בניצולת של 73$
)ראה "דיון"(.
בפטרה לפנוע את הניטרופנילאוקםיקרבונילציה של שיירי הליזין בוצעה תהילה אצטילציה
של ריבונוקליאזה עם אנהידריד אצטי.
ופעל
NPOCOClב-
7
בנוכתות
pH
8
M
לאהד חיזור ^אצטיל-ריבונוקליאזה עם פרקפטואתנול
אוריאה.
התוצר הכיל 6.3קבוצות ניטרופנוליות לפול.
התוצר לא נפם בתפיסה M1ביקדבונט גם לאהד הפום מפושך ב . -
את ה pH -ל•11.8-
5 0 °כ ד י להמיםו היה צורך להעלוה
כהוצאה פכך .השתהררו כל קבוצות הניטרופנול תוך 15דקות.
באנליזה
-C
תרפינלית של התוצר על ידי הידרזינוליזה נפצא רק ולין ) .(22$יש להניח כי ^־ pHהגבוה
גרם לשהרור הניטרופנול על ידי הידרוליזה ולא כתוצאה פציקליזציה לקטו-היאזולידין.
ג.
דיון
ביקוע קשרי
- Nציםטאין במודלים פפטידיים יוצא לפועל בניצולות בינוניות ).(30-70$
מאידך ניצולה שהרור הקבוצה העוזבח )11~-לפחות במקרה של ניטרופנול( היא כמותית.
יש להסיק
איפא ששלב האלימינציה ב' ושלב ההידרוליזה ג' מחחרים עם צורות הידרוליזה אתרות )כגון
הידרוליזה של הקבוצה ה-
האצילית או פהיהת החיאזולידין
.XXXXI
מקלארן ) (173הכין באהרונה הומצה -2קטותיאזולידין_-4קרבוכסילית
ציסטאין על ידי
-8אצילציה מלווה בהפעלת אלקלי מתון:
)11מ00נ(מ^-אצטיל-
- 92 -
HN
CH-COOH
CH
CH -CO-NH-CH-COOH
7
0=0
2
S
CH -CO-NH-CH-COOH
f
>
2
S
SH
R-CO-S
)(XXXXII
C J S
65
ממצא
התיאוזולידין
ריאקציה
תוצרי
זה הומך
XXXXIIעל
ד ה י י נ ו על
בהלבונים.
C
י
ידי
הומצה ציםטאית.
נ ו ס פ ת אה ש ע ו ר ה ב י ק ו ע של הקשר ה -
קביעת ההומצה הציםטאית ה -
^־אציל-
א -ט ר מ י נ ל י ה הנוצרת בחמצון
>
ניטרופנול.
COOH
באנליזה
ה א י ז ו צ י א נ ט י ם ע ל ו ל י ם ל י צ ו ר קשרים א מ י ד י ם
{
2
קיצוניות,
- 0ט ר מ י נ ל י ת של ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה שעברה את ש ל ב י
הנוצרות בההליך הביקוע.
ArCOCl.
=
הסיבה לאי מציאת חומצות א מ י נ י ו ת
כלורופורמטים
לרבות אלו
RNHCOOAr
0
י ו ה ד ס ל ק ט י ב י י ם עשוי
י י ש ו ם השיטה
יצירת אורתנים היכולים להפוך
עם ה ק ב ו צ ו ה ה ק ר ב ו כ ס י ל י ו ת ש ב ה ל כ ו ן ,
RN
שזו
לגבי
ק ב ו צ ו ת ת י א ו ל י ו ת ב ל ב ד מקשה ע ל
• ה ר י א ג נ ט מ ג י ב ג ם עם ק ב ו צ ו ת א מ י נ י ו ת ת ו ך
ל א י ז ו צ י א נ ט י ם תוך שהרור
ייתכן
הומצה פ ר פ ו ר מ י ת נ ו צ ר ת ב א ו פ ן כ מ ו ת י
ה ס ל ק ט י ב י ו ת של NPOCOCl
אינטראמולקולריים
= 0 + ArOHC
ידי
ה ו א ג ם מצא ש ב ח מ צ ו ן
הביקוע.
אי
־־
R = 4-NO C H O ,
'2 6 4
ב מ נ ג נ ו ן שהוצע ל ע י ל ל ר י א ק צ י ה ה ב י ק ו ע .
ז ו מאפשרת א י פ א ל ק ב ו ע ב ד ר ך
ציםטאיני,
.
CH
0
כולל שייר
+
2
־
הולין
תהליך הביקוע.
לסייע ביישום ריאקציה הביקוע
RNH +
R
= RN
המקורי,
פיתות
בהלבונים.
ו
- 93 -
ד
פרק
,
חלק נסיו ני
ת מ ר י ם
.1
תמרים שנתקבלו ממקורוח שינים
גלוטתיון נתקבל מחברת . Schvarz Bioresearch Inc.
ותומצה פלורטית נתקבלו מתברת
. Pluka
דנסיל כלוריד נחקבל מחברת . Koch-light
דיקרבובנזזוקסי-פנילאלניל-ציסטאיניל-גליצין אתיל אסטר,
גליצין אתיל אפטר,
פיקריל כלוריד ,הומצה גליאוקםלית
- S,N
-S,Nדיקרבזבנזוקםי-אלניל-ציסטאיניל-
- S,Nדיקרבובנזוקסי-אלניל-ציסטאיניל-גליציז אמיד ,אלניל-אלנין,
גלוטמיל-ולין ,םריל-אלנין ,טירוזיל-אלנין ,לויציל-גליצין ,ליזיל-פנילאלנין ,ארגינין אמיד
י - N -אצטיל-טירוזין אתיל אםטר נתקבלו פתברת "ידע"- S,N.דיקרבובנזוקסי-גלוטתייז ו- S -
דיניטרופניל-גלוטתיון נתקבלו מדייר מ .םוקולובםקי.
גליצין נתקבלו מדייר א .לויצקי.
.Chemical Company
- Nפירוביל-אלנין ו- N -פירוביל-גליציל-
ריבונוקליאזח )מוגבשה 5פעמים( נתקבלה פתברת Sigma
-כימוטדיפסין נתקבל מחברת
. Vorthington Biochemical Corporation
וירום מוזאיקה הטבק נהקבל מדייר ג .לוונשטיין ממכון וולקני להקר התקלאות ,בית דגן.
המרים שהוכנו לפי הספרות
- '2,2דיניטרודיפנילאמין ),(177
- Nפירוביל-גליצין ),(178
בנזיל אסטר ) ,(178הופצה פניל-פירובית ) ,(179נתרן טטרה-היונט )(180
ציםטאיניל-לויצין פתיל אםטר ),(170
- Sסולפו-גלוטהיון )(145
^פירוביל-גליצין
- S,Nדיקרבובנזוקסי-
- Sסולפו-ריבונוקליאזה ).(146
- pניטרופביל-כלורופורפט ) ,(181פניל-תיוקרבוניל כלוריד ).(182
הכנת
- Nקרבובנזוקסי- S -דיניטרופניל-ציטטאיניל-לויציז
1.55גר׳
ב 30-מייל מתנול.
א-8,דיקרבובנזוקםי-ציםטאיניל-לויצין פתיל אםטר ) 3פיליפול( הופםו
להפיםה נוספו 3פ״ל תפיסת נהרן פהילט 3נורפל.
למשך 30דקות ,ולאתר זאת נוספו 10פ״ל מים.
תופצת הופץ מהולה.
התפיסה נשפרה תחת חנקן
לאהר 30דקוה נוםפוה הורד ה pH -ל 6.0-עם
לתערובת נוסף 1מייל פלורודיניטרובנזן ) 8מילימול( ותערובת הריאקציה
הריאקציה נבהשה למשך שעח.
לאחר החמצה עם תומצת פלה פהולה םונן הפשקע הצהוב ) 1.35גר׳,
(85%וגובש מחומצת חומץ-מים.
נ.ה.182° .
- 94 -
אנליזה:
23
J6.00״ J״ C
עבור 0 S
מהושב ,4.87
; N
9
4
26
C ,־,׳; s
1
0,51.88 ; H,4.95 ; N,10.13 ; S ,5.85
נמצא:
הבנת
8
4
.
0
,
H; 51.68
-Nקרבובנז וקס י-8 -דינימרופניל-0-אצטיל-ציםטאיניל-טירוז ין-אמיד
^קרבובנזוקםי-8 -דיניטרופניל-ציסטאיניל-טידוזין-אמיד ) 0.22מילימול(
132מ״ג
טולטלו בתערובת של 2מייל אנהידריד אצטי .ו 1-מייל תריאתילאמין.
חומצת חומץ.
לאחר 5דקות נוספו 2מייל
לאהד הוספת 2מייל אתנול וכמה טיפוה מים שקע הומר צהוב שגובש ממתנול -הניצולת
97מ״ג ) (71$נ.ה.187° .
אנליזה:
'
מחישבת
ל פ י
SsVW
נמצא:
4.70} N, 10.7:
C, 53.43; H,
4,37; N, 11.2
?C, 53.75
H,
הכנה דנםיל פלוריד
332מ״ג דנסיל כלוריד ) 1.23מילימול( הומסו ב 1-מייל אצטוניטריל בחמום.
לאהר
הוספת 800מ״ג נתרן פלורי נבהשה התערובת באופן מגנטי למשך 8שעות באמבט שמן ב.83°-
הוספת 15מייל מים מוצתה התערובת חמש פעמים עם מנות בנות 10מייל אהד.
צורפו ויובשו מעל סידן כלורי.
התמיסות האחריות
לאחר נידוף עד יובש נוקתה השארית על ידי סובלימציה במכשיר
cold fingerב ,80^-בלחץ של 2מ״מ כספית.
פלורםצנסיה צהובה.
נתקבלו 230פ״ג של חומר גבישי צהבחב בעל
הניצולת .74$
אנליזה:
מחושב עבור
נמצא:
לאהר
H SO P
12 12 2
C
S,12.66; P, 7.50
;H, 4.78
;C, 56.90
S,12.51; F. 7.37
;H, 4.62
}C, 57«17
- 95 -
הכנת חומצה - N - gמלאיל-אפינו-קפרואית
6.5גר׳ הומצה - £אמינו-קפרואיה ) 0.05מול( הומסו ב 100-מייל מים שהכילו 15גרם
אשלגן ביקרבונט.
7
מירת
9
-
התמיסה קוררה ל ,0°-ו 2 5 -גר׳ אנהידריד מלאי נוספו במנות הוך 20דקוה,
pH
לאתר 3שעות בטמפרטורת ההדר סוננה התערובת.
עם אשלגן קרבונט מוצק.
התםנין הוחמץ ^־ pH3עם HC1מהולה ו ס ו נ ן ש ו ב ה מ ש ק ע י ם שנשטפו במים גובשו מאתנולתם..
נתקבלו 7.8גרם גבישים לבנים ,נ .ה .167 .
הניצולה .73%
אנליזה:
מהושב עבור
N, 6.11
a . H I
5כ ו
נמצא נ
-
£
.
2
} H, 6.60
N, 5.93
)
)XXXI
,
; 0.C, 52.39
H, 6.40 j
u1
ן C, 52.28
( ( D A D P A
12.5גר׳ י 2 , 2׳ -ד י נ י ט ר ו -ד י פ נ י ל א מ י ן ) 0.048מול( הומסו ב 150-מייל אתנול אבסולוטי.
,
לאהר הוספת 100מ״ג קטליזטור פהפן-פלדיום בוצעה הידרוגנציה חתה להץ במכשיר
ההידרוגנציה םוננה התמיסה תתת זרם הנקן.
מליגרואין.
התסנין נודף עד יובש.
נהקבלו 7.3גר׳ גבישים סגלגלים.
. Paar
בהום
השארית המוצקה גובשה
נ.ה 190° .הניצולת .76%
אנליזה:
ע ג י י
12 13 3
נמצא:
N
H
C
N, 21.09
} H, 6.57
} C, 72.33
N, 20.78
ן H, 6.93
ן C, 71.94
משקל אקויולנטי ) 100על י ד י טיטרציה עם הומצה פרכלורית בתומצת חומץ בנוכתות קריסטל
ו י ו ל ט כאינדיקטור(.
הכנת - 7.5ד י ה י ד ר ו - 6 -מ ה י ל -ב נ ז א י מ י ד ז ו -ק י נ ו ק ם ל י ג ו ז
200ם״גDADPA(1
מילימול( הומסו ב־ 3מייל אתנול.
הומץ 0.5נורמל נוספו 0.5הומצה פירוביה מזוקקה,
קירור ם ו נ נ ו ונשטפו במים ,כהל קר ואתר קר.
מדיאוקםן מימי.
נ.ה.233° .
)(XXXVI
לאתר הוספת 2מייל חומצה
הוף דקה שקעו גבישים לבנים שלאהר
הניצולה 228מ״ג ).(90%
ההומר גובש מהדש
- 96 -
אנליזה:
;
7
3
N
^ C
; N,16.72
:16.28,C,71.25נמצא;
הבנת
XXXVIמ ם ו מ ז
ב-
1
1
מייל
הומצה פ י ר ו ב י ת נוסף
8
8ו
, 5.18
Hp
5.03
. 0
1 8
0
H(60$0
לאתר
ד ק ו ת א ה ד ו ח שקע ח ו מ ר ל ב ן שנשטף ב מ י ם ב כ ה ל ק ר ו ב א ח ר .
הכנת 5״7
נ .ה .233° .
לתמיסה
.
ל א ת ר 24ש ע ו ת ב ט מ פ ר ט ו ר ת
DADPAב 3 -מייל א ת נ ו ל ש ה כ י ל ו 2$ח ו מ צ ת ח ו מ ץ .
ה נ י צ ו ל ה 127 :מ ״ ג ).(50$
0ב ש י ט ת ר י ט נ ב ר ג )(136
ד י ה י ד ר ו -ב נ ז א מ י ד ז ו — ק י נ ו ק ם ל י נ ו ז XXXVII
180מ ״ ג ה ו מ צ ה
נורמל.
באנליזה
1 8
(
2
החדר
גובש
H
;N
נ ו ס פ ו 0.5מייל מ ת מ י ס ה ז ו ל ת מ י ס ת 200מ ״ ג
מדיאוקםן-מים.
־ C , 71
.0
)(R=H
ג ל י א ו ק ם ל י ת מ ו נ ו -ה י ד ר ט ) 2מ י ל י מ ו ל (
נ ו ס פ ו 260מ ״ גDADPA(1.3
נ מ צ א ו 42$
1 8
ההומר
ה ו מ ס ו ב 2 -מייל ה ו מ צ ה ח ו מ ץ 0.5
מ י ל י מ ו ל ( מ ו מ ס י ם ב 3 -מייל א ת נ ו ל .
לאחר ד ק ו ת
א ח ד ו ת ש ק ע ח ו מ ר ל ב ן ) 220מ ״ ג (72$) ,ש ג ו ב ש מ ח ו מ צ ת ח ו מ ץ -מ י ם נ .ה 3 3 3 ° .
אנליזה:
,
H
C^H^NjO
70.86,4.64ן
:17.34נמצא4 . 3 2 ,
N
;
״
דרו7.5-בנזיל-בנזאמידו-קינוקסלינון
;
C
= C
287מ ״ ג ה ו מ צ ה
71.32
9
;H
(XXXVII)7H7R
פ נ י ל -פ י ר ו ב י ת ) 1.75מ י ל י מ ו ל (
250מ ״ גDADPA(1.25
ל א ח ר כ־־ 15ד ק ו ח שקעו
N , 17.71
C
ה ו מ ס ו ב 2 -מייל א ת נ ו ל .
מ י ל י מ ו ל ( מ ו מ ס י ם ב 2 -מייל א ח נ ו ל ו 1 . 5 -מייל ח ו מ צ ת ה ו מ ץ 0.5נ ו ר מ ל .
ג ב י ש י ם ל ב נ י ם ) 260מ ״ ג (66$ ,ש י ו ב ש ו מהדש מ ה ו מ צ ה ה ו מ ץ -מ י ם .
אנליזה:
מ
ח
ו
ש
ב
ע
ג
ו
י
:
0
C^K^jN,12.83ן
נמצא:
לתמיסה
נוספו
J H 5 . 2 0 , C , 77.07
N , 12.57ן
H , 5.23ן
C , 76.78
נ ״ ה .315° .
- 97
הכנת
^-אצטיל-ריבונוקליאזה
204מ״ג ריבונוקליאזה ) 15מיקרומול( הומסו ב 7-מייל תמיסת אוריאה 8מולד־
הוספה 100מ״ג אשלגן ביקרבונט ,קוררה התמיסה ל.0°-
המיםה המקודדת ,תוך שפיית
7
-
8
בטמפרטורה ההדר ירד pH-nל.5-
pH
לאחר
3מנות בנות 0.1מייל אנהידריד אצטי
אם אשלגן ביקרבונט.
לאהד עמידה של 45דקות
ההמיסה עברה דיאליזה נגד מים מזוקקים במשך 24שעוה.
ליופיליזציה נהקבלו 158פ״ג הלבון.
30מ״ג פההוצר הומסו ב 4-מייל מים.
לאהד
לדוגמא בת 0.2מ״ל
מתמיסה זו נוספו 2ט״ל תומצת מלה 6מולר ולאהר הידרוליזה טוטלית ) 22שעות ב (105°-ואנליזה
חומצות אמיניות נמצא כי הדוגמא הכילה 0.094מיקרומול ריבונוקליאזה.
מתפיסת ההלבון ) 1.41מיקרומול( נעשהה אנליזת
אמיניות ראשוניות ) 0.45מול למול תלבין(.
לדוגמא אהדת בת 3מ״ל
Van-Slykeונמצאו בה 0.63מיקרומול קבוצות
ז.א .ניצולת האצטילציה היתה ) 96%בריבונוקליזה
טבעית 11קבוצות אמיניות ראשוניות(.
הכנת
^-אצטיל-ריביניקליאזה מהומצנת
52פ״ג ^־אצטיל-ריבונוקליאזה הומסו ב 1-מייל הומצה פורמיה.
לאהד קרור ל 0°-נוספו
2מייל חומצה פרפורמית )הוכנה על ידי הוספה 0.5מייל מי הפצן 30%ל5-־ 9פ״ל הופצה פורפית ,98%
והעמדה למשך שעתיים בטמפרטורת ההדר(.
קרת והתמימה עברה ליופיליזציה.
לאתר שעתיים ב 0°-נוספו לתערובת הריאקציה 100מייל מי
בהידרוליזה טוטלית של דוגמא בת 5.2מ״ג מהתוצר מלווה באנליזה
תומצות אמיניות נמצאו 7.78שיירי הומצה ציסטאית למול תלבין.
הכנה ^סוקציניל-ריביניקליאזה
200פ״ג ריבונוקליאזה הומסו ב 12-מייל מים.
ה pH -הותאם ל 7-עם נהרן קרבונט.
300מ״ג אנהידריד סוקציני נוספו במנוה קטנוה במשך שעה ,תוך שמירת
לאהד שעה נוספה ירד
על ידי ליופיליזציה.
ה^pH -־.5
7
pH
עם נהרן קרבונט.
ההמיסה עברה דיאליזה נגד מים למשך 48שעוה ,ואהר כך נודפה
משקל ההלבון שההקבל היה 146מ״ג.
98 -
הכנת
-
- Nסוקציניל- S -דיניטרופניל-ריבונוקליאזה
82מ״ג ) 6מיקרומול( - Nסוקציניל-ריבונוקליאזה הומסו ב 4-מייל המיסה
M
8
אוריאה.
לאהר הוספת 0.3מייל מרקפטואתנול ) 4.65מילימול( הותאם ה pH -ל 8.6-עס תמיסת מהילאמין .5$
כלי הריאקציה נשטף בתנקן והתערוכה הועמדה ל 45-שעות בטמפרטורת ההדר.
לאהד הורדת הpH -
ל 6.0-עם חומצח חומץ• מהולה ,נוספו 2.5מייל -4,2פלורודיניטרובנזן ) 21מילימול( ,תוך בחישה
מגנטית חזקה.
3
N
לאחר 90דקוה הוספה לתוף התמיסה 220מייל אצטון הומצי ) 30מייל הומצה גפרתיח
בתוך ליטר אצטון(.המשקע הופרד על ידי צנטריפוגה ונשטף מספר פעמים עם אצטון חומצי עד
העדר ניטרופנול בנוזל השטיפה.
מכנית והתרחיף נמהל ל 10-מייל.
מיקרומול
דוגמא הכילה
לאתר שטיפות נוספות במים ,הורחף המשקע על ידי הומוגנציה
0.2מייל עברו הידרוליזה טוטלית.
. ( 8 8 $ ) 5 . 3
נמצאו 0.106מיקרומול חלבון
0.1מייל מהםופפנםיה הומסו ב 10-מייל• NNaOH0.1
כעבור 30דקות היתה הבליעה המקסימלית 0.67ב1 -ף,4081לאהר הוספת 20מיקרוליטר תמיסת יוד
מתאים )לפי =13800
4-
^- xlO
0.42
(
M
מולר
דיניטרותיאופנולט ,כלומר 7.9מול דיניטרותיופנולט למול הלבון )•(99$
ה
כ
נ
ח
ת
ל
ב י ז
ה
_( T M V(164
ל 4-מייל תמיסת הוירוס 5$נוספו 8מייל תומצת הומץ קרתית קרה.
הופרד המשקע על ידי צנטריפוגה ) 8000סיבובים בדקה למשך חצי שעה(.
מים ונעשתה דיאליזה נגד מים ב 4°-למשך 3ימים.
ט
pH
4.7
3
M
סינון.
בטבלה מס׳ .12
לנוזל העליון נוספו 12מייל
לחרהיף שנוצר הוך כדי הדיאליזה נוספו 3טיפות
)40,000,והמשקעהופרד על ידי אולטרה-צנטריפוגה
שעה( .המשקע הומם על ידי הוספתNNaOH0.01
לאחר 15דקות ב3°-
סיבובים בדקה ,למשך
עד ,pH7.8ונוקה משאריות בלתי מסיםוה על ידי
ההמיםה ) 25מייל( הכילה 1.66מייג הלבון
היחס בין עצמת הבליעה המקסימלית )280|1
TMVלמייל.
m
הרכב החומצות האמיניות מופיע
(247היה .2.47
( והמינימלית
כדי לקבוע את תכולה הקבוצות הסולפהידדיליוה בהלבון ה TMV -נודפו 2מייל )0.18
מיקרומול( עד יובש על ידי ליופיליזציה.
בבופר פוספט
0
412הבליעההאופטית ב-גךז
.
השאריה הומםה ב 2-מייל תמיסת גואנידיניום ברומיד
7.1
, M 0 . 2 , p Hשהכילה M5
.
חישוב רכוז
הקבוצה התיאוליה )לפי (165) ( £ ^ = 13600מראה כי החלבון הכיל 0.72קבוצות תיאוליות למול.
- 99 -
מכשירים ושימות כ ל ל י ו ת
,11
ברופטוגרפיה כמותית על גיר
הכרומוטוגרפיה נעשתה על ניר ווטפן מם' 1בשיטה היורדת.
ו-בוטנול • :מומצת הופץ :מים ) 25 : 6 : 25לפי הנפת(.
16שעוה.
כממס מפהת שימשה תערובת
הרצת הממס המפתה נעשתה בדרך כלל .
בגמר הרצה הממם המפתח ,יובש הניר בתנור למשך 20רגע בטמפרטורה של .60 - 70°
לאהד מכן הוטבל ניר הכרומטוגרם באמבט שהכיל תמיסת נינהידרין 0.5%באצטון שהכיל 15%מים.
פיהוה הצבע נעשה על ידי חימום למשך 20רגע ב.60 - 70°-
הכתמים הנינהידריניים של ההומרים
הנבדקים ושל הסמנים נגזרו לפסים דקים ומוצו בעזרת 7מייל אתנול .75%
הבהולה נקבעה בעזרה קולורימטר מטיפוס
בליעת האור של התמיסה
Klett Summersonמצויד בפילטר מס׳ .56
אלקמרופורזה במתה גבוה
האלקטרופורזה בוצעה בניר ווממן מם׳ 1במכשיר שתוכנן על ידי דרייר ועוזריו ).( 182
מפל הפחח היה 50וולט לם״ם.
ככופרים שימשו תפיסות של פירידין -תומצת חומץ ב-
3.6
pH
או
.6.5
-
מדידוח ספקטרוסקופיוח
נעשו בספקטרופוטומטר מטיפוס
Beckman Model DK - I Recording Spectrophotometer
מדידוה פלואורםצנסיה
-pHstנ ם ו י ו י ם
נעשו בספקטרופלואורומטר מטיפוסנערכו במכשיר מטפום
ב
-
Aminco Keirs
type TTT
b1RadiometerTitrigraph
הידרוליזה טוטלית של פפטידים וחלבונים
ההידרוליזה בוצעה בתמיסת חומצת מלח 6נורמל בפבהנה חתומה שהוממה ב 105°-במשך 22
שעות.
אנליזת תופצות אמיניוה
Spin
Beckmanנעשתה
במכשיר
Acid Analyser
Amino
- 100 -
מדידות
באינפרא-אדום
I n f r a c o r d Spetcrophotometer
Beckmanגבוהה
השתמשנו
מדידות ב -
7
3
1
ל
ד
מ
במכשיר
י
ד
ו
ת ברזולוציה
Spectrophotometer
n.m,r.
במכשיר
Varianנעשו
High
R e s o l u t i o n NMR Spectrophotometer
םפקטרה-מםות
נמדדו
קביעה
ב מ כ ש י ר MAT Mass Spectrophotometer 4ע ל י ד י דייר נ .
נ י נ ה י ד ר י נ י ת ב ת מ י ס ה )(156
להמיסה
)הריאגנמ
ה נ ב ד ק ת ) 1 - 2מייל
15ד ק ו ת ב א מ ב ט מ י ם ר ו ת ה י ם .
קביעת
בתמיסות
נינהידריז ו 3-גר׳
5.5
. ( p H
נ ו ס פ ו 1מייל ר י א ג נ ט
הידרינדנטין
נינהידרין.
ב 7 5 0 -מייל מ ת י ל צ ל ו ז ו ל ב ,
ה מ ב ה נ ה כ ו ם ה ה ב מ כ ס ה א ל ו מ י נ י ו ם ו ה ו מ מ ה למשך
ל א ה ר ה ו ס פ ת 10מייל ת מ י ס ת א ת נ ו ל 1 : 1
נ ק ב ע ה עצמת ה צ ב ע
הנינהידריני
.570
-4.2דיניטרותיופנול
הקביעה
~ 4 2 0
ב ר כ ו ז 0.2 - 0.05מ י ל י מ ו ל ר (
ה ו כ ן ע ל י ד י ה מ ס ת 20ג ר ׳
ו ה ו ס פ ת 250מייל ב ו פ ד נ ת ר ן אצטט 4נ ו ר מ ל ,
ב-
דניאלי.
mji
נעשתה ב ש י ט ה ה ם פ ק ט ר ו ם ק ו פ י ת של
ס ו ק ו ל ו ב ס ק י )(193
של ת מ י ס ה מ ת נ ו ל י ת מ ח ו מ צ נ ת ע ם י ו ד ל ע ו מ ת ז ו
מ י מ י ו ת נקבע ה י ו ן על י ד י
מדידת הבדלי
הבליעה
ב 4 0 8 -
המבוססת על מדידת הבדל בבליעה
של ת מ י ס ה ב ל ת י מ ת ו מ צ נ ת )= 15700
, m uלאהר
M
.(£
צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה של ת ו צ ר
ה ת מ צ ו ן ) 4 = 13800ן • ( £
קביעת
חומצה
פ י ר ו ב י ת )(127
השיטה
D F N Hל
פו
.
0.05מייל ת מ י ס ת
מ ב ו ס ס ת על ה י ז ו ר הומצה פ י ר ו ב י ת על י ד י
5
3מייל מ ת מ י ס ת ה ח ו מ צ ה ה פ י ד ו ב י ת ) " 3.10"^ - 6.10מ ו ל ד (1$
. ( L . D . H (0.01$.
האקםטינקציה
ד ה י ד ר ו ג נ ז ה לקטית )
. D N P H
לאחר
1 - 2דקות נמדדה הבליעה ש ו ב .
ה מ ו ל ר י ת .6220
בבופר פוספט
ל א ת ר מ ד י ד ת ה ב ל י ע ה ה א ו פ ט י ת ב-גןות 340
ר כ ו ז החומצה
( L.D.H.
בנוכחות
,pH7.4
נ ו ס פ ו 0.05מייל ת מ י ס ת
ה פ י ר ו ב י ת נקבע על פי
־ - 101
אנליזה ^טרמינלית בשיטת הציאנט )(128
קרבפילציה של הקבוצות ה 0 ( -א מ י נ י ו ת של הערובה
השיטה מבוססת על ארבעה שלבים :א.
הפפטידים״
ציקליזציה בתומצת מלת תוך יצירת ההידנטואינים של התומצות האפיניות
ב.
הקיצוניוה ,המלווה ביצירת פפטידים ותומצות אפיניות תופשיות.
על פהליפי יונים.
קרבפילציה:
א.
ד.
ג .ניקוי והפרדת ההידנטואינים
הידרוליזה של ההידנטואינים וקביעת התומצות האמיניוה הפשהתררות.
ל 1-פיקרופול הלבון פבוקע ) 3 - 5פ״ל( נוסף נפה שווה של תפיסת א-אתיל-
פורפולין )הובנה על ידי הרספת 8פ״ל - Nאתיל-פורפולין פזוקק ל 12-פ״ל פים והורדה ^ p Hל8-
עם חופצת חופץ קרחית(.
לאחר הוספת 300פ״ג ציאנט האשלגן הופפה ההפיסה ל 50°-לפשר לילה.
לאהר נידוף התמיסה עד יובש הומסה השאריח ב 1-מייל חופצח חופץ ) (50%תוך פירוק עודף הציאנט.
התמיסה הועברה באופן כמותי )בעזרת חומצה חומץ (50%למבהנה ,ולאהר הוספה נפח שווה של תומצת
מלח מרוכזת נתתמה המבהנה בואקום והוממה למשך שעה ב.105°-
מים3
ןב1-מיםNaOH,
0
1
N
10x
N HC6 ,
)
ולבסוף
.(p.s.i
פ
י
לאהר נידוף הוכן המבהנה הומסה
Dowex
ס
1
.
2x-
50
ם״מ(
)גובה הקולונה נמדד בלחץ אויר של
הקולונה פותחה עם מים במהירות של 100מייל לשעה.
30המייל הראשונים נאספו
כפרקציה Aהמכילה אה ההידנטואינים של ההופצוה האפיניות הנייטרליוה וההופציוה וכן של -N-£
אצטיל-ליזין.
40מייל נוספים נאספו כפרקציה , Bהמכילה את ההידנטואין של הומוציטרולין
)במקרה ששיירי הליזין לא עברו אצטילציה(.
נודפה עד יובש.
ה
השארית הומםה ב 2-מייל מים ,ו 1.8-מייל מהטיסה זו הושפו על קולונה
קודם לכן בבסיס הנתרן
בתומצת פלה .M0.8
הקולונה נשטפה ב 40-פ״ל אמוניה
1
, Mוהתמימה
,N
(
הקולונה פותחה עם הומצה מלח
0.8
M
במהירות של
בשעה.60
מייל
נאספה הפרקציה 20 - 35מייל ) ( C - 1העלולה להכיל את ההידנטואין של היםטידין ,והפרקציה
.35 - 7 0
מייל ) ( C - 2המכילה אה ההידנטואין .של ארגינין.
כל הפרקציוה יובשו והועברו
הידרוליזה כדלהלן :פרקציות A1 -NNaOH^ B0.2למשך 20שעות ב ,105°-ב 0ו־C-jופרקציות -
2
1N HC6למשך 96שעוה ב.105°-
יזין גם בחלק מפרקציה Aשעבר הידרוליזה
^
במקרה שהתלבון המקורי הכיל שיירי
6למשך
אצטיל-ליזין,
9 6 N H C lשעות.
נבדקהN-
הואיל ובתנאי
- 102 -
הציקליזציה חלה הידרוליזה של קבוצה ה-א-אצטיל בשעור של ,(124) 50$תוקן בהתאמה הערך
שהתקבל עבור ליזין.
לנסיון ביקורת בצענו אנליזה קצה של תערובת פפטידים שהכילה אלניל-
אלנין ,גלוטמיל-ולין ,סריל-אלנין ,טירוזיל-אלנין ,לויציל-גליצין ,ליזיל-פנילאלנין,
אספרגין וארגינין-אמיד.
תוצאות האנליזה היו כדלקמן) :בסוגריים מצונים הניצולות שתוארו
בספרות ) (128אלנין (98$) 9 5 $ -הומצה גלוטמית (60$) 65$ -םרין ,(203) 35$ -טירוזין -
,(96$) 63$לויצין (97$) 97$ -ליזין (84$) 80$ -הומצה אםפרטית (99$) 98$ -ארגינין -
.(76$) 66$
בנסיון בלנק עם הריאגנטים המופעלים בשיטה האנליזה נמצאו 0.18מיקרומול גליצין
ו 0.12 -מיקרומול אלנין.
תוצאות האנליזות תוקנו בהתאם לערכים אלה.
אנליזת-קצה - Cטרמינלית
האנליזה בוצעה בשיטת ההידרזינוליזה ,על ידי הימום הדוגמה היבשה
עם 1מייל הידרזין אנהידרי ל 105° -במשך 10שעוח ,במבחנה חתומה בואקום.
הורחק על ידי נידוף בואקום מעל תומצה גפרתית מרוכזת.
) 1 - 2מיקרומול(
עודף ההידרזין
על השארית נעשתה אנליזח חומצות
אמיניות במכשיר האוטומטי.
.111
נ 0ו י י ם
אלימינציה של קבוצות דיםולפיד מ- N -אצטיל-ריבונוקליאזה.
אצטיל-ריבונוקליאזה הומסו
-
הותמצה התמיסה עם 1מייל .ה ו מצת תומץ 2נורמל.
ה
ב
1
בשיטה האנזימתית שתוארה לעיל.
ב 1 0מייל . N NaOH0.1
לאחר 30דקות
ל 1 -מ״ל מתערובת הריאקציה נוסף 1מ״ל
105°למשך שעתיים נקבעה כמוה החומצה הפירוביתהדוגמה הכילה 0.7מיקרומול חומצה פירובית.
דוגמה אחרת בת 0.5מייל מתערובת הריאקציה עברה הידרוליזה הומצית טוטלית מלווה
באנליזה הומצוה אמיניוה.
לפי האנליזה הכילה הדוגמה
0.13מיקרומול חלבון.
שיירי הדהידרואלנין שנוצרו על ידי האלימינציה היתה .2.7שיירים למול תלבון.
הריאקציה נודפה עד יובש והשארית הומסה ב 1 -מייל חומצה פורמית.
ז״א כמוה
יתרת תערובת
התמיסה קוררה ל 0° -ונוספו
- 103 -
2מייל חומצה פרפורמיה.
ליופיליזציה.
לאהד שעתיים ב 0° -נוספו מייל מי קרה והתמיהה נודפה על ידי
השארית הומםה ב 3 -מייל מים ודוגמה בה 0.1מייל נלקהה להידרוליזה טוטליה
ואנליזת תומצות אמיניות.
תוצאות האנליזה מופיעות בטבלה מסי .1
לשם ביקוע תוצר האלימינציה נוסף לתמיסה 1מייל מי חמצן 30%ו 4 -ם״ל
NaOH
לאתר 45דקות בטמפרטורת החדר נוטרלה התמיסה על ידי הוספת 0.4מייל תומצת תומץ
0.03מייל המיסה 5%קטלזה.
שתוארה לעיל.
A
5
.0.2N
1ונוספו
לדוגמה בה 5מייל מהתמיסה נעשתה אנליזת קצה בשיטת הצי אנט
הואיל והחלבון הביל שיירי הומצה ציסטאיה אשר פפטידים שלהם אינם ספרדים
- x2
נוקתה פרקציה
פת על קולונה של
של ההידנטוא׳ינים
1 - x8
0.9
x 6) Dowex
רגנרציה על ידי שטיפה ב , N a O H*2-מים וחומצה הומץ
פ״ל נוקתה על קולונה זו על ידי אלוציה עם תומצת הומץ
.0.05
ס״מ( שעברה קוד|ם ל כ ן
פרקציה Aשרוכזה לןנפת של 2
0.05במהירוה של 60מייל לשעה.
110המייל הראשונים נאספו כפרקציה י Aוהמשך הטיפול היה כמתואר לעיל.
האנליזה
תוצאות ה
מםוכמוה בטבלה מס* .2
מהירוה האלימינציה של דיניטרותיופנולט מ- N -סוקציניל - s -דיניטרופניל-ריבונו? יאזה
בטמפרטורות שונות.
ל 1 -מייל סוספנםית ^סוקציניל- s -דיניטרופניל-ריבונוקליאזה ) 0.83מיקר|־מול(
ב 1 0 ° -מייל תמיסה
נשטף בהנקן.
9.2
בפרקי זמן שונים הוצאו דוגמאות של 0.2מייל לתוך 1מייל בופר בורט 0 . 0 5 .
H
0.2
NaOH0.2
N
-
מלווים ב 8מייל תמיסת . N NaOH0.1כלי לריאקציה
p
N
.
־
, t y
לאתר מדידת עצמת הבליעה האופטית ב -ץש ,408נוספו 20מיקרוליטר תמי^ת יוד
הבליעה נמדדת שניה ,ורכוז הדיניטרותיופנולט נקבע מתוך הפרש ערכי הבלןעה
)לפי .(? ^ = 13800דרגה האלימינציה נקבעה לפי רכוז הדיניטרוהיופנולט שהשההרר־
דומה בוצע ב.25° -
התוצאות מסוכמות בציור מס* ,1עקומוה Iו.III -
}סיון
-
מהירות
14.4
ה א ל י מ י נ צ י ה על ק ב ו צ ו ת ד י ם ו ל פ י ד
מ״ג
בואקום ותוממו
0
כמתואר ל ע י ל .
ו ת של ת ו צ ר
ב 1 0 -מייל ת מ י ס ה ^ 0 1 1
מייל מ ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה
נתתמו
זימתי
מ ^ -ם ו ק צ י נ י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה בטמפרטורות שונות.
- Nס ו ק צ י נ י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה הומסו
-
- 104
1
דכוז
ב 1 0 5 ° -למשך ש ע ת י י ם .
H
התלבון
p
1מייל מ ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה .
ידי
השואת ר כ ו ז החומצה
התוצאות
1
^
בתערובת הריאקציה
ה ה י ד ר ו ל י ז ה הטוטלית )בתומצת
לאחר
0
M
,
II
עקומוה
ההלבון.
ב.0°-
ל 1מייל ה ו מ צ ה מ ל ח . N 4
המבהנוה
ה ה י ד ר ו ל י ז ה עם א ש ל ג ן
ביקרבונט,
ר כ ו ז החומצה ה פ י ר ו ב י ת נקבע ב א ו פ ן
5
9 . 5
6
ב א נ ל י ז ה לא נמצאו ש י י ר י
מ ס ו כ מ ו ת ב צ י ו ר מם׳
.
)~x 10
ה פ י ר ו ב י ת עם ר כ ו ז
0.1
נ י ס ר ו ל תוצרי
.
מ ל ה 2 2
,1
ונוספו
N
בפרקי
N
( M
-
נ ק ב ע על
שעות
ליזינואלנין.
ידי
אנליזה
ב ( 1 0 5 °של ד ו ג מ א בת
דרגת האלימינציה
נ ק ב ע ה על
ב א ו פ ן דומה נקבעה מהירות ה א ל י מ י נ צ י ה
ב.25°-
ו-זת.
- Sפ ק י ר י ל צ י ה של מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל
1
תמיסת
על
.
0
1
410מ ״ ג פ י ק ר י ל כ ל ו ר י ד
ידי טיטרציה
א ח ד של
הקבוצות
גלוטתיון
המיםת
מתערובת
)1.6
מילימול(
5.8
ב 8 -מייל א צ ט ו ן .
י ו ד ו מ ט ר י ת של ד ו ג מ א ו ת מ ת ע ר ו ב ת
י ו ד בתמיסת חומצת חומץ מ ה ו ל ה ,
הראקציה
ת כ ו ל ה ה ק ב ו צ ו ת ה ת י א ו ל י ו ת נעקבה
) 2ק ב ו צ ו ת ת י א ו ל י ו ת מ ג י ב ו ת עם מ ו ל
תוך התתםצנות לקבוצה דיםולפידיוז( ,תוך 5דקות ירדה תכולת
ה ח י א ו ל י ו ח ל 4 $ -מערכה ה ה ת ח ל ת י .
- Sפ י ק ר י ל צ י ה של
590מילימול)1.9מ ״ ג
4
.
מ י ל י מ ו ל ( ב 1 2 -מייל ב ו פ ר אצטט
M0.5 pHנ ו ס פ ה
גלוטתיון
( ב 2 0 -מייל ב ו פ ר אצטט
496מ ״ ג פ י ק ר י ל כ ל ו ר י ד
ה ר י א ק צ י ה הראתה על
) 2.0מ י ל י מ ו ל (
5.8
pH
ב 1 6 -מייל ד י א ו ק ם ן .
י ר י ד ה של ״ 88,ב ת כ ו ל ת ה ק ב ו צ ה
)
טיטרציה
5
.
0
M
(
נוספה
י ו ד ו מ ט ד י ת של ד ו ג מ א ו ת
ה ת י א ו ל י ת ת ו ך 20ד ק ו ת .
-
הכנה
ו ב ק ו ע של
^ 1 1 0
פ״ג
הוספת
לאהר
נשפרה
0
1
הזקה.
0
יודומטרית.
1
N
3
מייל מ ה ת ר ח י ף
-10
.M0.1
0.6ש י י ר י
נגזרת ההלבון
שעה
עד
נוספו
N
ב0.1
השאריוח הומסו
מייל של ה ב ס י ס י ם
ב-
מייל מ ה ת ר ה י ף
נ
ו
ל
מ ה ו א ר י ם ב צ י ו ר י ם מם' 3
pH
1
0
ו . -
2
ל א ה ר התאמת
נקבע ר כ ו ז ההומצה
ו ב צ י ו ר מם'
הוספה
ליופיליזציה חוזרת.
ו 5 -מייל N NaOH0.3
«
N
ה 1 & -ל 7 . 4 -עם
ה פ י ר ו ב י ה בשיטה
.N2
.M0.1
לאתר
לאהר
נדוף
נ ו ס פ ו 2פ״ל הומצה פרפורמית
לייפיליזציה.
ההוצר הופס ב 3-פ״ל פים.
.
4ה ת פ י ס ו ת
.3
2.5מ ״ ל ת ו מ צ ת ת ו מ ץ
פורפית וקיררה ל.0°-
,
2
5פ״ל הפיסה הריאהיל-אפין
ל א ה ד ה י ס פ ת 80פ ״ ל פ י ק ר ת נעשהה
M0.2 ,פי!.ל מ י ח מ צ ן
^NNaOH0.1
מייל ח ו מ צ ת מ ל ת
4
י י ב ש ה ו פ ם ה ה ש א ר י ת ב 2 -מייל ה ו פ צ ה
הוםםה
ד ו ג פ ה בת
לאתר ש ע ת י י ם ב 0 ° -נ ו ד פ ה
,O.OINNaOH
ה ח ו צ א ו ח מ ם ו כ מ ו ה בטבלה מם' 5
ש נ י ה ב 50-פ״ל פ י ם ונעשהה
)(79%
לאהד ה י ד ר ו ל י ז ה ב ת נ א י ם ה ר ג י ל י ם הראתה א נ ל י ז ת
7.4
נשפרה לפשך ש ע ת י י ם ב . 0 ^ -
5.8פ י ק ר ו מ ו ל
) 0.1פ ״ ל ( שעברה ה י ד ר ו ל י ז ה ט ו ט ל י ת .
.
בטמפרטורת החדר ה ו ר ד ה ־ ־ & ל ! 5 . 5 -על י ד י
והתפיסה
פ
שהוארה ל ע י ל .
צ נ ט ר י פ ו ג צ י ו ה באצטון
כפות ההלבון שנהקבלה היתה
1.8מייל מ ה מ י ם ו ה א ל ה ח ו מ מ ו למשך ש ע ת י י ם ב . 1 0 5 ° -
ל-
ידי
הופצי
הוםצה ציםטאיה ל מ ו ל ה ל ב ו ן .
ו מ י ה ו ל ל 1 0 -מייל עם ב ו פ ר פ ו ס פ ט
האנזימהיה
י ר ד ה ת ו ך 20ד ק ו ת ל א פ ם ,ל פ י
לאחר ש ט י פ ו ה על
ה ס פ ק ט ר ה של ה ה מ י ם ו ה ש ה ה ק ב ל ו
ו נ ו ד פ ו עד י ו ב ש .
ד ו ג מ א ו ה של
ביקרבונט
2
מייל מ ה ה ר ה י ף ה ו מ ס ו
ותדיאתיל-אמין
ייל ח ו מ צ ה מ ל ה
6
ל 6 . 0 -בעזרה הופצה הופץ
פ י ק ר י ל כ ל ו ר י ד ב 8 -נלל אצטון ת ו ך ב ה י ש ה
נ ו ד פ ה ע ד י ו ב ש ו ה ו מ ס ה ב 2 -מייל ח ו מ צ ה פ ר פ ו ר מ י ת .
א מ י נ י ו ת ת כ ו ל ה של
ד ו ג מ א ו ה של
1מייל
ה
.M8
התפיסה
י ד י ה ו ס פ ת ה ת ע ר ו ב ת ל 2 5 0 -מייל א צ ט ו ן
ך ליטר אצטון(.
מייל ת ו מ צ ת מ ל ה
תומצות
לבקוע
ב
ו
ה ה ל ב ו נ י הושקע על
ו ב פ י ם הורהף התוצר ב 10-ם״ל פ י ם .
N21
לאחר ה ו ר ד ת ^ p H -
א ו ר א ה פ ל ו ו ה בתפיסת 5ג ר י
א נ ל י ז ה ה ו פ צ ו ה א פ י נ י ו ה של ד ו ג פ ה ה ה ר ה י ף
0.2
הופסו
תכולת הקבוצוה ההיאוליוה בהערובה הריאקציה
התוצר
ב 6-פ״ל תפיסת אוריאה
ה ^ -ל 8 . 6 -ב ע ז ר ת ת פ י ס ת פ ת י ל -א פ י ן .5%
נ
טיטרציה
אשלגן
אצטיל-ריבונוקליאזה
ב ט פ פ ר ט ו ר ת ה ח ד ר תחת ח ק ן לפשך 10ש ע ו ת .
מגנטית
לפי
) 7.3פ י ק ר ו פ ו ל (
0.3פ ״ ל פ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל ה ו ע ל ה
8
ארית הוםםה ב -
א-אצטיל-3-פיקריל-ריבונוקליאזה
פ״ל תפיסה M
הופצי
- 105
השארית
לתפיסה נוספו
ל א ת ר 45ד ק ו ת ב ט פ פ ר ט י ר ת ה ה ד ר
נוטרלה
- 106 -
התפיסה על י ד י
חופצת הופץ
5מייל מ ה ת מ י ס ה ה ו צ א ה
וסולק עודף מי
התפצן על י ד י
ה ו ס פ ת 0.3מייל ת פ י ס ת 5$ק ט ל ז ה .
התוצאות מ ס ו כ מ ו ת בטבלה
ל א נ ל י ז ת -ק צ ה בשיטה ה צ י א נ ט שתוארה ל ע י ל .
מ ס ׳ .8
נםיונות
.1
י ס ת)0.11מ ״ ג
,ת מ י ס ת 43מ ״ ג ד נ ם י ל כ ל ו ר י ד ) 0.16מ י ל י מ ו ל ( ב 1 -מייל ד י א ו ק ס ן ) נ ק י
34
גלוטטיון
.6.0
מייל
להכנת
,3.5
ל ד ו ג מ א ו ת של
A
10-50
3000ו ו ל ט במשך ש ע ת י י ם .
בתמיסת
דנםיליח,
וחומר
תגובת
נינהידרין
חיובית.
הומצי
מוצה מהניר
)לאחר
פלווהב 0.1-פ״ל
הפך לחומצה
של 0.2
•pK-z
אלקטרופוריזה
ניצולת
הגלוטטיון
אלקטרופורזה
ו מ י ם )(15$
דנםילית.
לא
נמצאו
ה מ ח ו מ צ ן ה י ת ה .86$
תוזרת ,ללא טבילה
N NaOH
מכאן שהחומר
ו א ה ר ת ו מ ם ב 6 0 ° -למשך 20ד ק ו ת .
ה כ ת מ י ם ש נ ת ג ל ו ה י ו של
פחוח חומצי מחוםצה
0.01
דנסילית.
M0.05
לאתר ס י מ ו ן הכתמים ה פ ל ו ר ם צ נ ט י י ם נ ט ב ל נ י ר ה א ל ק ט ר ו פ ו ר ז ה
ה א ל ק ט ר ו פ ו ר ז ה מ ו פ י ע ו ה ב צ י ו ר מ ם ' .4
פלורסצנטי
,pH
טיטרציהיודומטרית
מ ת ע ר ו ב ה ה ר י א ק צ י ה נעשת
נ י נ ה י ד ר י ן 0.5$ב ת ע ר ו ב ת של א צ ט ו ן )(85$
תוצאוה
מפראוקסידים(
מ י ל י מ ו ל ( ב 5 -מייל ב ו פ ר פ ו ס פ ט
כ ע ב ו ר 20ד ק ו ת י ר ד ה ת כ ו ל ה ה ק ב ו צ ו ת ה ת י א ו ל י ו ה ל א פ ם ,ל פ י
מהערובהיהריאקציה.
N
-Sדנםיל-גלוטתיו ז
כתמים
פלורםצנטיים בעלי
הכתם ה פ ל ו ר ם צ נ ט י
בנינהידרין(,
והורץ שנית
הפלורםצנטי
גלוטתיון
מחומצן,
הומצה
הפחות
ה ו מ ס ע ם 0.1מייל
באלקטרופורזה.
הפחות חופצי ה י ה חופצה
נמצא שהוא
- Sדיפתילאפינו-
נפלתן-1-םולפינית.
.2
ל ת מ י ס ת 67.5מ ״ ג
IR-45
בנוזל
)צורת
.( 0H
ה ע ל י ו ן לא ה י ו
בדימתיל-פורמאמיד,
הספות(.
) 0.215מ י ל י מ ו ל ( ב 3 -מייל מ י ם
ל א ה ר ב ה י ש ה מ ג נ ט י ת במשך 30ד ק ו ה ה ו פ ר ד השרף ע ל י ד י
יותר קבוצות
היאוליוה ,לפי
טיטיציה
יודומטרית.
צנטריפוגה.
השרף נשטף מ ס פ ר פ ע מ י ם
ו א ח ר כ ך נ ב ת ש במשך 45ד ק ו ת עם 3מייל של ת מ י ס ת 33מ ״ ג כ ס ף ת נ ק ת י
בדימתיל-פורמאמיד.
תיאוציאנאם
גלוטתיון
נ ו ס פ ו 350מ ״ ג
Araberlite
הראתה כ י
השרף ה ו פ ר ד ש ו ב ב צ נ ט ר י פ ו ג ה ,
0.21פ י ל י מ ו ל
ל א ת ר ש ט י פ ו ת של השרף
י ו נ י כסף
ו ט י ט ר צ י ה של
נ ש א ר ו ע ל השרף
בדימתיל-פורמאפיד
ה נ ו ז ל ה ע ל י ו ן עם ת מ י ס ת
) נ י צ ו ל ת של 97$ל ג ב י
ובדיפתיל-אצטאפיד,
הגלוטתיון
נ ב ה ש השרף ע ם 3מייל
־
תפיסת
נטריפוגה
100מ ״ ג ד נ ס י ל כ ל ו ר י ד
ושטיפה ב ד י פ ח י ל -א צ ט א פ י ד ,
20
דקות.
נפצא רק
נםיון
לאהר
פ ח ו ז ר ) ה ו פ ר הפוצא( כשעור
פ״ג ד י ב ו נ ו ק ל י א ז ה הופםו
ה ו ע ל ה pH-n
בטפפרטורת התדר.
פר פוספט
לאחר
אלוציה
הפרקציה
דנםיל-ליזין.
נתקבלו
pH
באלקטרופורזה.
ב מ י ם ב ק צ ב של 60פ ״ ל ל ש ע ה .
130פ ״ ג של
צהובה,
ן ז ל ו נ ת םפדקם0-25-
ה ו פ ע ל N NaOH0.1
6
N
ב 1 0 5 ^ -במשך 22ש ע ו ת .
תערובת כ ל ו ר ו פ ו ר ם ,
בוטנול שלישוני
ב א ל ק ט ר ו פ מ ־ ז ה של ד ו ג מ ה מ ה פ ר ק צ י ה
ק ו ל ו נ ח םפדקם
G-25׳
ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה פחוזרת שהכילה
ב-
ץמ.4121
החלבון
4.5
7.7
הפחוזר
80מ ״ ג ד נ ס י ל כ ל ו ר י ד פ ו פ ם י מ ב 3 -
)45
2.5
x
חלבונית
ם״פ( ,תוך
) 105פ ״ ג ( ב ע ל ת
ב ל ת י -ת ל ב ו נ י ת בעלת פ ל ו ר ם צ נ ם י ה כ ח ו ל ה -י ר ו ק ה .
ה ח ל ב ו נ י ת לא ה כ י ל ה ק ב ו צ ו ת ת י א ו ל י ו ת ח ו פ ש י ו ת ל פ י
למשך
0.3פ ״ ל
ה ת ע ר ו ב ת נ ש פ ד ה תחח ח נ ק ן לפשך
ב פ ב ת נ ו ת 19 - 32נ א ס פ ה פ ר ק צ י ה
ו ב פ ב ח נ ו ת 45 - 59נ א ס פ ה פ ר ק צ י ה
לאחר ה ו ס פ ת
כ ר ו ם ט ו ג ר פ י ה על
0 . 0 5ו ל ת מ י ס ה נוספו
ל א נמצא ,כ ת ם פ ל ו ר ס צ נ ט י "נוטף ל ז ה של
דנםילית
8Mאוריאה.
הופרד מהתערובת״על ידי
0.1נ ו ר מ ל .
M, p H
מ״ג מנגזרת החלבון
בחומצת מלת
עם
ב 5 -מייל ת פ י ס ת
45ד ק ו ת ה ו פ ר ד ה ה ת ע ר ו ב ת ע ל
פלורםצנםיה
3.5
לפשך
.90$
ת י א ו ל י ו ח ל פ ו ל ח ל ב ו ן ל פ י ק ב י ע ה ם פ ק ט ד ו ם ק ז פ י ו ז עם ENB׳D
6.7
12
3.5
והשארית הופסה ב פ י ס והורצה
ל 8 . 6 -עם ת מ י ס ת 5$פ ת י ל א פ י ן .
החלבון
א ל ו צ י ה עמ ח ו מ צ ת ח ו מ ץ
קבוצות
פ״ל ד י א ו ק ס ן .
הנוזל העליון
לאחר הפרדה
להכין - Sד נ ס י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה
פרקפםואתנול,
תוך
ב ד י מ ת י ל -א צ ט א מ י ד ,בפשך שעה.
נ ב ח ש השרף ב־ד 10פ ״ ל ת פ י ס ת פ י ו י ד י ן אצטט
צנטריפוגה נודף
גלוטטיון
168
שעות
) 0.37ם י ל י פ ו ל (
- 107
^.30דקות,
נגזרת החלבון.
ק ב י ע ה ם פ ק ט ר ו ם ק ו פ י ת עם . DTNBע ל
ב א ל ק ט ר ו פ ד ז ה של מ ד ג ם מ ה ת ע ר ו ב ת
3.3מ ״ ג ה ל ב ו ן ע ב ו ר
pH
הידרוליזה טוטלית
ב כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה של ה ה י ד ר ו ל י ז ט ע ל ר ו ב ד ד ק של ס י ל י ק ה
ו ח ו מ צ ת חומץ
הבלתי-חלבונית
והומצה - 1ד י מ ת י ל -א מ י נ ו -נ פ ת ל ן - 5 -ם ו ל פ י נ י ת .
): 70
: 30
3.5
(3
) (184נ מ צ א כ ת ם פ ל ו ר ס צ נ ט י של
pH-o
נמצאו
חופצה
-
- 0ד נ ס י ל צ י ה של
וטריפםין
- 108
ביפוסריפסין,
מ י ק ר ו מ ו ל ( ה ו מ ס ו ב 3 0 -מייל ב ו פ ר פ ו ס פ ט
נ ו ס פ ו ב ע ז ר ת pH-stat
לתמיסה
פלוריד
7.05
בקצב אטי
2
ב ת ו ך 5מייל ד י א ו ק ם ן)M~2.78.10
ושווה תוך
.
(
םטר
) 5מ ״ ג במייל( ב -
)pH-stat
ה ה ה ה ל ה י ה של ה ה ל ב ו ן .
של
4.5ש ע ו ה 2.0מייל ת מ י ס ה
בעלה
נמדדה ע״י מהול
. ( p H
ה פ ע י ל ו ת של ה ה ו צ ר ה י ת ה 4%מ ה פ ע י ל ו ת
ה ח ל ב ו ן הופרד מהערובה הריאקציה על י ד י
ב ר ו מ ט ו ג ר פ י ה על
.
נ א ס פ ה ב מ ב ת נ ו ת מ ם ' 46 - 110ו נ ו ד פ ה ע ל י ד י
ליופיליזציה.
ק ו ל ו נ ת םפדקם
הפרקציה
נ ת ק ב ל ו 870מ ״ ג של א ב ק ה
פלורםצנםיה צהובה.
א ל י מ י נ צ י ה של ה ו מ צ ה ד נ ם י ל י ה
״ג -0דנםיל-כימוטריפסין
ב
הומסו
0.5מייל ת ו מ צ ת ה ו מ ץ
-
5
מ-0-דנםיל-בימוטריפסין .
.
1
מייל
0
M1.0.1
ל פי מדידה פלורומטריה
N NaOH
^
הריאקציה
נ ו ך פ ו עד י ו ב ש ו ה ש א ר י ה ה ו מ ם ה .
ב 2 -מייל
למשך ש ע ת י י ם נ ^ ב ע ה כ מ ו ת ה ה ו מ צ ה ה פ י ר ו ב י ת בשיטה ה א נ ז י מ ט י ה .
0.47מ י ק ר ו פ ו ל .
דוגמא
ואנליזת
הדנסילית
בריאקציה
-
נ ו ס פ ת בת
היתה
0.5ש י י ר י
דהידרואלנין
של ה ק ב ו צ ה ה ד נ ס י ל י ת .
לפול,
N H C l . 2ל א ה ר ה י ד ר ו ל י ז ה ב105°-
כמוה ההופצה ה פ י ר ו ב י ת בדוגמא
0.06מ י ק ר ו מ ו ל ה ל ב ו ן .
0.87מ ו ל ל מ ו ל ה ל ב ו ן ,
1.3פ ו ל ל מ ו ל ה ל ב ו ן .
דנסיליה(.
3מייל
0.5מייל מ ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה נ ל ק ח ה ל ה י ד ר ו ל י ז ה ט ו ט ל י ת
ת ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ת ו נ מ צ א ו בה
שהשחחררה ה י ה ה א י פ ו א
ו ר כ ו ז החומצה
1Qm33 -
מ ק ס י מ ל י ת ב-גןש (460ה ו ך ה ש ו א ה עם ע ק ו מ ת כ י ו ל של ת מ י ס ה ה ו מ צ ה
מהערובה
היהה
ב.0°-
לאהר 4שעוה נ ו ט ר ל ה
מייל מ ה ת מ י ס ה נ מ ה ל ל 1 0 -מייל עם מ י ם
M
ופליטה
0.6
35.5מ ״ ג ד נ ם י ל
0.05מייל מ ת מ י ס ה ז ו ל 5 -מייל ת מ י ס ת א צ ט י ל -
(.
התלבונית
מ י ס ה עם
pH
ה פ ע י ל ו ה ה א נ ז י מ ח י ת של ה ת ו צ ר
0.1מייל מ ת ע ר ו ב ה ה ר י א ק צ י ה ל 1 0 -מייל מ י ם ו ה ו ס פ ת
8.2
. M 0 . 0 5
הואיל
נוצרו
וכמוה שיירי
ו ב כ י מ ו ט ד י פ ס י ן טבעי
0.7 - 0.8ש י י ר י
כמות ההומצה
הדהידרואלנין שנוצרו
נוצרים בתנאי
האלימינציה
ד ה י ד ר ו א ל נ י ן כהוצאה מהאלימינציה
- 109 -
- Sדיניטרופניל ריבונוקליאזה.
תיוליזה של
230פ״ג ציםטאמין הידרוכלוריד ) 2פילימול( הומסו ב 20-פ״ל בופר טריס 0.5מולר
8,1
ל 4-פ״ל פתפיםה זו נוספו 28פ״ג - Sדיניטרופניל
,..pHשהכיל 8פולר אוריאה.
לאתר 1.5שעות בטפפרטורת התדר ,תהה חנקן ,נוספו לתמיסה 200פ״ל אצטון
ריבונוקליאזה.
הופצי ) 10פ״ל הופצה גפרהיה 3נורפל בתוך ליטר אצטון(.
באצטון ובפים.
הפשקע שנוצר נשטף פםפר פעפים
התפיסות האצטוניוה הצהובות צורפו ונודפו עד יובש.
אתיל אצטט והתפיסה טולטלה עם 20פ״ל תפיסה חופצת פלח 0.1נורפל,
השאריה הופסה ב 30-פ״ל
)360
הצבע הצהוב
mu־־
ן
מ״ל. NNaOH0.110
לא עבר לפזה המימית״המשקע החלבוני הומס ב-
max
לא הופיעה כל בליעה
מייל מתמיסה זו נודף עד יובש והשארית הומםה ב־־ מייל חומצה פרפורמית ב0°-
למשך שעתיים.
לאחר נידוף התמיסה הומםה השארית ב־ 2מ״ל תומצת מלת 6נורמל ונעשתה הידרוליזהי
טוטלית בתנאים חרגילים.
למול תלבון.
אנליזה חומצוח אמיניוח חראחח חכולה של 78שיירי חומצח ציםטאית
לא נמצאו שיירי
- Sאמינו-אתיל-ציסטאין.
ריאקציה של - Sדיניטרופניל-גלוטתיון עם סולפיט.
ל 4-מייל תמיסה
- Sדיניטרופניל-גלוטתיון ""10
3
1,8
x
מולר בבופר טריס 0.2מולד pH
7.4ב־־ ,38°נוסף 1מייל תמיסת נתרן םולפיט 1.0מולד באותו בופר.
0.5
גמאות של 0.5מייל מתערובת הריאקציה ונוספו ל 5-מייל
NaOH
הדיניטרותיופנולט במדגמים נקבע על ידי הבליעה האופטית a־ 4 0 8
מסי .7
בפרקי זמן שונים הוצאו
נורמל.
.mp
רכוז יון
התוצאות מסוכמות בציור
בכרומטוגרפית־־ניר של דוגמאות מתערובת הריאקציה נמצאו מלבד הומר המוצא גם גלוטתיון
מתו זר ועקבות גלוטתיון מחומצן.
ריאקציה של ^-םוקציניל- S -דיניטרופניל-ריבונוקליאזה עם סולפיט.
0.5מייל תרהיף - Nםוקציניל- S -דיניטדופניל-ריבונוקליאזה ) 0.265מיקרומול( נוספו
ל 4-מייל תמיסת בופר טריס 0.2מולר
pH
8.2
שהכילה 8מולד אוריאה.
מייל תמיסת 1. 0מולר נהרן םולפיט באותו ממם.
ח הריאקציה והוחמצו
^ 2 -
עם חומצח מלח 0.01מולד.
-
3
pH
בפרקי זמן שונים הוצאו דוגמאות בנות 1מ״ל
עם חומצת מלה מהולה.
חמשקע חומס ב 10-מייל חמיםח
להמיסה נוספו ב1.1 38°-
0.2
הדיניטרותיופנולט נקבע לפי הצפיפוה האופטיה ב11-ם.4081
התלבון ששקע צונטרפג ונשטף 3
NaOH
N
.
רכוז יון
התוצאות מסוכמות בציור מם׳ .8
110 -
השפעת ח ו מ צ ה פ ר פ ו ר מ י ה ע ל
א.
י כ ו ל ת ה ה ו ר ד ה ה ר ב ר ם י ב ל י ת של ק ב ו צ ת מ ל א י ל .
100מ ״ ג ה ו מ צ ה - ^ £.מ ל א י ל -א מ י נ ו -ק פ ר ו א י ה ) 0.44מ י ל מ ו ל (
ה ו ה א ם ל 7 -ו ה ה מ י ם ה נ מ ה ל ה ל 1 0 -מייל.
3.6
H
-
p
0.5מייל ) 22מ י ק ר ו מ ו ל (
,ל א ת ר ת מ ו ם ה ת מ י ס ה ל 5 0 ° -למשך 4ש ע ו ה
ה ו מ ס ו ב 8 -מייל
נ ו ס פ ו ל 7 -מייל ב ו פ ר
ב . 0 ° -לאתר שעתיים
ם״ל
. Amino a c i d a n a l y s e r
6.34מ ״ ג ה ו מ צ ה — N-fcמ ל א י ל -א מ י נ ו ־ ־ ק פ ר ו א י ה ) 26.5מ י ק ר ו מ ו ל (
.O.INNaOH
נ ו ס פ ו 50מייל מ י ם ו נ ע ש ת ה
ל א ח ר ה ו ס פ ת 7מייל ב ו פ ר
שעות.
ליופיליזציה.
פ י ר י ד י ן אצטט,
3.5
א נ ל י ז ת ת ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ה כ נ ״ ל הראתה כ י
פ י ר ו ד י ן אצטט,
נ ו צ ר ו 21.3מ י ק ר ו מ ו ל ה ו מ צ ה - £,א מ י נ ו -ק פ ר ו א י ת
) (97%כ פ י ש נ ק ב ע ב ע ז ר ת כ ר ו מ ט ו ג ר פ י ה ע ל ה ק ו ל ו נ ה ה ק צ ר ה של ה -
ב.
O.INNaOH
^pH
pH
ה ו מ ס ו ב 1 -מייל ה ו מ צ ה פ ד פ ו ר מ י ת
ב0.5-
ה ה ו מ ר ה ל ב ן שהתקבל ה ו מ ם
ה ו מ מ ה ה ת מ י ס ה ל 5 0 ° -במשך 4
-£.אמינו-קפרואית
נ ו צ ר ו 25.5מ י ק ר ו מ ו ל ה ו מ צ ה
).(92%
ק ב ו צ ת - Nפ י ר ו ב י ל על י ד י
ביקוע
להלן
פירוביל-גליצין
DADPA
דוגמת
נסיון
באתנול
בבקוע - Nפ י ר ו ב י ל
ב א ה נ ו ל ה ו מ מ ה ה ת מ י ס ה ל 5 0 ^ -למשך ש ע ה .
ת ג ו ב ה עם
נינהידרין
ב נ ם י ו ן אתר ב ו
ו ג ו ב ש מהומצה הומץ-מים.
ונדידה
ג ל י צ י ן :ל 0 . 4 -מייל ת מ י ס ת 0.05מ ו ל ר
נ ו ס פ ו 1.2מייל ת ו פ ץ 0.5מ ו ל ד .
של 20מ י ק ר ו ל י ט ד מ ה נ ו ז ל ה ע ל י ו ן
לאתר
DADPA
כרומטוגרפית
נמצא
לאהד
לכדומטוגרפית-ניר,
גליצין
ל א ת ר ה ו ס פ ת 0.4מייל ת מ י ס ה 0.09מ ו ל ד
צ נ ט ר י פ ו ג ה של המשקע ש נ ו צ ר
בבוטנול-תומצת-תומץ-מים כמהואר ל ע י ל .
התוצר
זוהה כ -
^-פירוביל-גליצין,
ב ו ד ד המשקע ) 250מ ״ ג (
XXXIVל פ י ה ש ו א ת ס פ ק ט ר ו ם א י נ פ ר א -א ד ו ם
) ב ר ו ב ד ד ק של ם י ל י ק ה -ג ל Hf =0.74 ,ב ^ -־ ב ו ט נ ו ל -ת ו מ צ ת ה ו מ ץ -מ י ם (1:1:4
ע ם ד ו ג מ ה א ו ט נ ה י ה של ה ת ר כ ו ב ה .
באופן
נלקתו
דוגמאות
ב נ י צ ו ל ת של .80%
נבקע בתנאים הנ״ל 1מ י ל י פ ו ל
נ .ה .233^ .
-N
דומה נבקעו
תרכבוה - Nפ י ר ו ב י ל י ו ה אתרות כפסוכם בטבלה פ ס י
.7
-
בקוע
- Sדינטרופניל-פפטידים
מהלך
24
מתילט
ב-ץז1
שעה,
הביקוע
.420
ד ו ג מ א ו ה של
) 52מ י ק ר ו מ ו ל (
0.5מייל
ביקוע הידרוליטי:
חומצת מלח
מ״ג
DADPAמ ו ס ס י ם
ב.
15
ה ו מ ס ו ב־־ 3מ ״ ל א ת נ ו ל ,
ד י נ ט ר ו ת י ו פ נ ו ל ט ב נ י צ ו ל ת של
) 6.5מ י ק ר ו מ ו ל (
הדוגמא
ב 1 -מייל א ת נ ו ל
3.5
בקוע מחמצן:
לויצין
)פעמיים(.
ו 1 . 5 -מייל ח ו מ צ ח ח ו מ ץ 1מ ו ל ד .
. p H
ב 1 -מייל א ח נ ו ל
ב נ י צ ו ל ת של
לשארית
נ ו ס פ ו 2מייל מ י ם
באורה דומה
.61$
אצטי.
הוספת
הועמדה
5פ״ל
נורמל,
הפפטידים
יובש.
לאהר נ ד ו ף עד י ו ב ש נ ו ס פ ו
ל א ח ר ח מ ו ם ב 5 0 ° -למשך
ב נ י צ ו ל ת של
.55$
ו נ ו ד פ ה עד
השארית הומםה
יובש.
נ ו ד פ ה ה ח ו מ צ ה ה פ ר פ ו ר מ י ת על
ו ה pH -ה ו ע ל ה ל—11
ו נ ו ד פ ה עד
ו 1 . 5 -מייל ח ו מ צ ת ה ו מ ץ 1
נבקעו
זו,
ו נ ו ד פ ה עד
לאחר
יובש.
עם NaOH
ידי
מהולה.
ל א ח ר ה ו ס פ ת 45מ ״ ג
לאחר
DADPA
ו ה מ ו ם ב 5 0 ° -למשך שעה נ מ צ א ב א ל ק ט ר ו פ ו ר ז ה
- Sדיניטרופניל-גלוטתיון
כמסוכם בטבלה מם'
ו^! -קרבובנזו-
.8
ריבונוקליאזה.
157
העלאת
נמצא
לויצין
לאתר שעתיים בטמפרטורה
קסי-8-דיניטרופניל-ציסטאיניל-טירוזין-אמיד,
ביקוע
נלקהו
96$ל פ י
נ ו ט ר ל ה עם ח ו מ צ ת מ ל ח מ ה ו ל ה
ד ק ו ת ה ו ח מ צ ה ה ת מ י ס ה עם ח ו מ צ ת ח ו מ ץ מ ה ו ל ה
מומםים
לשלבי
קביעה םפקטרוםקופית
הביקוע הבאים.
ה ד ו ג מ א נ ו ט ר ל ה עם ח ו מ צ ת ה ו מ ץ מ ה ו ל ה
חומצה פרפורמית ב.0^-
ליופיליזציה
לאחר ה ו ס פ ת 1פ ״ ל נ ת ר ן
0.01נ ו ר מ ל נ ה ה מ ה ה מ ב ה נ ה ו ה ו ם מ ה ב 1 0 5 ° -למשך שעה.
דוגמאות לאלקטרופורזה ב-
ב0.5-
- Nקרבובנזוקםי- 8-דיניטרופניל-ציסטאיניל-לויצין.
0.5נ ו ר מ ל השהתרר ת ו ך 15ד ק ו ת
נוספת
נלקתו
יוגדם בבקוע
מ ״ ג של ה פ פ ט י ד
א.
45
111
-
מ״ג ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה
ה pH -ל 8 -עם א ש ל ג ן
) 11.5מ י ק ר ו מ ו ל (
הומסו
ב 5 -מייל ת מ י ס ת 8מ ו ל ר א ו ר י א ה .
ב י ק ר ב ו נ ט קוררה התמיסה במי-קרה
ו נ ו ס פ ו 3מ נ ו ת של
ל א ה ר ה א צ ט י ל צ י ה ה ו ש א ר ה ה ת מ י ס ה למשך שעה ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ת ד ר ת ו ך
0.4מייל מ ר ק פ ט ו א ת נ ו ל
תחת ח נ ק ן למשך
מהקבוצות
0.1מייל א נ ה י ד ר י ד
י ר י ד ה ה pH -ל . 5 . 8 -
) 5.6מ י ל י מ ו ל ( ה ו ע ל ה ה pH -ל 8 . 6 -עם ת מ י ס ת 5$מ ת י ל -א מ י ן .
4.5ש ע ו ת ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ה ד ר .
-4,2פלורו-דיניטרובנזן
לאתר
) 40מ י ל י פ ו ל (
ה ת י א ו ל י ו ת שבתערובת הריאקציה לפי
לאהר
התערובת
ל א ה ר ה ו ר ד ה ה pH -ל 6 . 0 -עם ת ו מ צ ת ת ו מ ץ נ ו ס פ ו
ת ו ך בחישה מ ג נ ט י ת ח ז ק ה .
טיטרציה
ת ו ך שעה ה ג י ב ו
י ו ד ו מ ט ר י ת של ד ו ג מ א מ ה ת ע ר ו ב ת .
95$
הנגזרת
- 112 -
החלבוניה
הושקעה על י ד י
ה ו ס פ ת 220מייל א צ ט ו ן
ליטר
אצטון(.
לאהר
ה ו מ ו ג נ צ י ה מ כ נ י ת ה ו ר ח ף ה ה ל ב ו ן ב 1 0 -מייל מ י ם .
להידרוליזה
הלבון
המשקע ה ו פ ר ד ע ל י ד י
ח ו מ צ י ) 10מייל ח ו מ צ ה ג פ ר ו ז י ו ז 3נ ו ר מ ל ב ת ו ך
טוטלית
).(85%
צ נ ט ר י פ ו ג צ י ה ונשטף 3פעמים באצטון ו 3 -פעמים ב מ י ם .
ו א נ ל י ז ת חומצות א מ י נ י ו ת .
מייל מ ה ח ר ח י ף
ל-5
לפי
ד ו ג מ ה של 0.2מייל מ ה ח ר ה י ף ה ו צ א ה
ה א נ ל י ז ה ה כ י ל ה ה ד ו ג מ ה 0.196מ י ק ר ו מ ו ל
נ ו ס פ ו 5מייל ה מ י ס הNNaOH0.2
צי דקה נמס החלבון ה ו ך הופעת בליעה אופטיה ב m p 4 0 8 -ל א ה ד
של
1
ץט
היתה
0
.
ירדה
מייל
-
.
. 0 . 6 0 4 0 8 1
ל א ח ר ה ו ס פ ת 0.1מייל ה מ י ס ה י ו ד
הבליעה ל.0.08-
ההפרש ב ב ל י ע ה ה א ו פ ט י ה ) (0.52מ ה א י ם
ו מ כ א ן שהשתחררו
מתערובה
45ד ק ו ת ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ה ד ר
ו נ מ ה ל ה ל 1 0מייל עם N NaOH0.1
הריאקציה
והוםמה
pH7.4
פירובית
ב א ל מ י נ צ י ה 7.7ק ב ו צ ו ת
נוטרלה
ו נ ו ד פ ה עד יובש.
ל 1 0 5 ^ -במשך ש ע ת י י ם .
נקבעה כ פ ו ת החומצה
לאהד
ל 0.038-מיקרומול
נ י ט ר ו ל התמיסה
ד ו ג מ ה א ה ר ה ) 0.2מייל(
N
2
נמצאו
ה פ י ר ו ב י ת שבהמיסה בשיטה ה א נ ז י פ ח י ת .
נחתמה המבחנה
מ י ק ר ו מ ו ל הומצה0.72
ד ה י ד ר ו א ל נ י ן ממול ה ל ב ו ן .
נורמל
ו נ ו ד פ ה עד יובש.
השארית
ל א ה ר ה ו ס פ ת 2מייל ה ו מ צ ה פ ר פ ו ר פ י ת מ ק ו ר ר ת נשמרה
ל א ה ר ה ו ס פ ת 100מייל מ י ק ר ת נעשתה
ליופיליזציה.
ו ל י ו פ י ל י ז צ י ה ת ו ז ר ת ה ו פ ם ה השארית ה א ב ק ת י ה ב 3 -פ ״ ל מ י ם .
NaOHמ ה ו ל ה .
דיניטרוהיופנולט
ו מ י ה ו ל ל 1 0 -מייל עם ב ו פ ר פ ו ס פ ט 0.1מ ו ל ר
ת ע ר ו ב ת ה ר י א ק צ י ה ה ו ה ם צ ה ע ם 2מייל ה ו מ צ ה ה ו מ ץ 2
ה ת מ י ס ה ב 0 ° -למשך ש ע ה י י ם .
התמיסה
ו צ נ ט ר י פ ו ג ה של המשקע ש נ ו צ ר
ל א ה ד המסה ב 1 -מייל ח ו מ צ ת מ ל ח
ה ו מ ס ה ב 2 -מייל ח ו מ צ ה פ ו ר מ י ה ו ק ו ר ר ה ל . 0 ° -
מייל מ י ם
N0.1
ה ב ל י ע ה ה א ו פ ט י ת של ה ה מ י ס ה
ד י נ י ט ר ו ה י ו פ נ ו ל ט ממול הלבון.
ה מ ת א י מ י ם ל ה י ו צ ר ו ח 7.3ש י י ר י
יתרת
•
.
ל א ה ר ה מ ו ם ב 5 0 ° -למשך
לאהד המסה ב 5 0 -
ה pH -ה ו ע ל ה ל— 11עם ת מ י ס ת
ל א ת ר 15ד ק ו ת נ ו ס ף 1מייל ת ו מ צ ת ה ו מ ץ 50%ו 8 6 -מ ״ ג DADPAמ ו מ ם י ם ב 1 -מייל א ת נ ו ל .
ה ו מ מ ה למשך שעה ב , 5 0 0 -
ולאחר
נ י ד ו ף עד
י ו ב ש מ ו צ ת ה ה ש א ד י ה ב 3 -מ נ ו ה של 7מייל א ה ר .ל א ה ד
ה מ ס ת ה ש א ר י ת ב ב ו פ ר - Nא ת י ל -מ ו ר פ ו ל י ן נעשתה א נ ל י ז ה -ק צ ה ב ש י ט ת ה צ י א נ ט .
ב נ ס י ו ן אהר ב ו צ ע שלב ה ב י ק ו ע ה א ח ר ו ן ע ל י ד י המסת ה י צ ר ה ח מ צ ו ן
M, 11מייל מ י ת מ צ ן 30%ו
-
התמיסה עם חומצת ח ו מ ץ ,
הוצאות
3
1
מייל ת מ י ס ת
ה פ ר פ ו ר מ י ב 3 -מייל מ י ם ,
. N NaOH
ל א ת ר 45ד ק ו ת נ ו ט ר ל ה
ו ל א ה ר ה ו ס פ ת 0.3מייל ת מ י ס ת 5%ק ט ל ז ה ב ו צ ע ה א נ ל י ז ת ק צ ה ב ש י ט ת ה צ י א נ ט .
ה נ י ס ו י י ם מ ס ו כ מ ו ת ב ט ב ל ה מ ס י .8
- 113 -
בקוע מריפטי של
^אצמיל-8 -אמינו-אהיל-ריבונוקליאזה.
177מ״ג ריבונוקליאזה ) 13מיקרומול( הומסו ב 5-מייל תמיסת
עם מי קרח ^ pH-הובא ל 8-על ידי הוספת אשלגן ביקרבונט.
אצטי תוך שמירת
וה-
8
pH
עם אשלגן ביקרבונט.
שעוח ,ואחייב נמהלה ל 20-מייל עם תמיסה
24שעוח.
התערובה נשמרה בטמפרטורת החדר חחת תנקז למשך 12
אוריאה.
מנה של 4מייל עברה דיאליזה נגד מים למשך
יחרח התערובח נוספח לתמיסה 40גרי -2מהיל-2-אמינו-3,1-פרופן-דיאול) (121ב 50-מייל מים
9.7מייל חומצת חומץ )
למשך שעה.
שעות.
8
נוספו 4מנות של 0.2מייל אנהידריד
לאחר שעה בטמפרטורה החדר נוספו 0.5מייל מרקפטואתנול
pHהועלה ל 8.6-עם תמיסת מתיל-אמין .5$
M
8אודיאה.
התמיסה קוררה
8.6
. ( p Hל א ח ר הוספת 7.5מייל אתילן-אמין נבהשה התערובת בטמפרטורת החדר
לאתר הוספת נפח שווה של מים נוקתה נגזרת •ההלבון על ידי דיאליזה נגד מים למשך 72
לאהר ליופיליזציה נתקבלו 97מייג של
אנליזה חומצות אמיניוה 5.2 ,שיירי
- Sאמינואהיל-ציסטאין למול תלבון.
הומסו ב 20-מייל מים וה pH-הובא ל.7.5-
ם ,לאחר אינקובציה עם 0.4מייל תמיסת 1$
DFP
- Nאצטיל-8 -אמינואתיל-ריבונוקליאזה שהכילה ,לפי
80מייג מנגזרת התלבון
ההמיסה עוכלה עם 3מייל תמיסת טריפםין ) 20מייג ב 8-מייל
( למשך 12שעות ,תוך שמירת
באופן דומה בוצע עיכול טריפטי למנת החלבון המתוזר שלא עבר
7.5
pH
-8אמינו-אתילציה.
מיקרומול .מתוצרי העיכולים נעשו אנליזות קצה בשיטה הציאנט שהוארה לעיל.
בpH stat -
לדוגמאות בנות 2
התוצאות מסוכמות בטבלה
מס׳ .8
בקוע כימומריפםין ,
192מייג כימוטריפםין ) 7.8מיקרומול( הומסו ב 8-מייל תמיסת 8מולר אוריאה.
לאתר קירור
עם מי קרח הועלה ה pH -ל 8-עם אשלגן ביקרבונט.
אצטילציה בוצעה עם 3מנות של 0.1מייל אנהידריד
עם אשלגן ביקרבונט.
לאהר שעה בטמפרטורת ההדר הועלה ה pH -ל 8.6-עם
7
שמירת
-
8
pH
תמיסת 5$מתיל-אמין ונוספו 0.5מייל מרקפטואתנול ) 7מילימול(.
בטמפרטורה ההדר למשך לילה.
) 44פילימול(.
ה pH -הורד ל 5.8-עם חומצח חומץ ונוספו 5.5מייל פלורודיניטרובנזן
לאחר שעה ירדה תכולת הקבוצות ההיאוליוה ל 6%-מערכה ההתתלתי ,לפי םיטרציה
יודומטרית של דוגמה מתערובת הריאקציה.
N3
לאחר שטיפה בחנקן הועמדה התערובת
לאהר
הוספה 200מייל אצטון חומצי ) 10מייל הומצה גפרתיה
בתוך ליטר אצטון( הופרד המשקע על ידי צנטריפוגציה ונשטף
לא הופיע יותר צבע צהוב לאחר חמום באלקלי.
פעמים עם אצטון תומצי עד שבאצטון4
- 114 -
המשקע נשמף 3פ ע מ י ם ב מ י ם ,
0.2מייל נ ל ק ה ה ל ה י ד ר ו ל י ז ה ט ו ט ל י ת
מיקרומול
לאחר
ולאהר
ה ו פ ו ג נ צ י ה מ ב נ י ה ה ו ר ה ף ב נ פ ה של 25מ ״ ל .
ו א נ ל י ז ת ה ו מ צ ו ת א מ י נ י ו ה ) ט ב ל ה מ ם ׳ .(10
ח ל ב ו ן .()77%ל 1 0 -מייל מ ה ת ר ת י ף ) 2.4מ י ק ר ו מ ו ל (
ה י מ ו ם ב 5 0 ^ -למשך ה צ י ד ק ה נ מ ס ה ה ל ב ו ן
ה י ה ה .0.89
ב^-ש408
ה י ת ה ה ב ל י ע ה ה א ו פ ט י ה .0.10
תלבון.
נוספו
נוטרלו
1מייל עם ב ו פ ר פ ו ס פ ט 0.1מ ו ל ר
ו נ ו ד פ ו עד
7.4
לאהר
יובש,
הערובה הריאקציה
נקבעה כ מ ו ה ההומצה ה פ י ר ו ב י ה בשיטה ה א נ ז י מ ה י ה .
דהידרואלנין
פקוררה.
ל א ה ר ש ע ה י י ם ב 0 ° -נ ו ס פ ו 125פ ״ ל פ י ק ר ה ו ה ת פ י ס ה ע ב ר ה
ליופיליזציה הוזרה.
ל א ת ר שעה ב ט פ פ ר ט ו ר ת ה ה ד ר ה ו ר ד ^ p H -
לתפיסה
בקוע
חלבון ה -
1.3
השאריה ה ו פ ס ה ב 2 -פ ״ ל פ י ם .
נ ו ס פ ו 0.5מייל מ י
הפצן
נורפל.
הpH-הועלה
ו 3 - 3 0 %פ ״ לNNaOH0.2
.
ל א ה ר ה ו ס פ ה 0.3פ ״ ל ת פ י ס ה
ה ת ו צ א ו ת מ ס ו כ מ נ ו ת ב ט ב ל ה פ ס ׳ .11
פ י ק ד ו מ ו ל ת ל ב ו ן 7TMה ו מ ס ו ב -10מייל ת מ י ס ת
0.2פ ״ ל ת פ י ס ת 10%
ל א ה ר שעה ב ט מ פ ר ט ו ר ת ה ח ד ר
נוקחה
הרהיף התלבון
ע ם 10פ ״ ל א צ ט ו ן ,ע ד ש ה א צ ט ו ן ל א ה כ י ל
יותר עקבות
.
ג ו א נ י ד י נ י ו ם ב ר ו מ י ד .M5־ ^ p H
- 4 , 2פ ל ו ר ו ־ ־ ד י נ י ט ר ו ב נ ז ן בכהל
נ ג ז ר ה ההלבון על י ד י
ו א ה ״ כ נ ג ד פ י ם למשך 24ש ע ו ה .
ב
ליופיליזציה.
האבקה שנתקבלה
TMV
ל 6 -עם ת ו פ צ ת ת ו פ ץ .
שעות
ל.5.5-
ההמיסה
ל א ה ד ק י ר ו ר ל 0 ° -נ ו ס פ ו 2מייל ה ו פ צ ה פ ר פ ו ר מ י ת
ל 7 . 5 -עם ה ו פ צ ה ה ו פ ץ 2
5%ק ט ל ז ה ב ו צ ע ה א נ ל י ז ת ק צ ה ב ש י ט ת ה צ י א נ ט .
למול הלבון.
נורמל ,הוד הורדה הpH-
נ ו ד פ ה עד
ל -8עם 0.3פ ״ ל ה פ י ס ה N NaOH0.2
ו ל א ה ד המסה ב 1 -מייל ה ו מ צ ה מ ל ה
נמצאו
נ ו ס פ ו 2מייל ה1מצה ה ו פ ץ 2
.
ד י נ י ט ר ו ת י ו פ נ ו ל י ו ת למול
נ י ט ר ו ל עם ה מ י ס ה NaOHמ ה ו ל ה
יובש והשארית ה ו פ ס ה ב 3 -פ ״ ל הופצה פ ו ר מ י ה .
הופםה ש ו ב ב 100-פ ״ ל פ י ם ונעשתה
צנטריפוגציה
ומיהול
0.324מ י ק ר ו מ ו ל ה ו מ צ ה פ י ד ו ב י ה ה מ ת א י מ י ם ל ה י ו צ ר ו ה 9.0ש י י ר י
ליתרה
.O.INNaOH
הבליעה האופטית
0.1מייל ח מ י ם ח י ו ד 0.1נ ו ר מ ל ו ל א ח ר
2נ ו ר מ ל נ ה ה מ ה ה מ ב ח נ ה ו ה ו מ מ ה ל 1 0 5 ° -למשך ש ע ת י י ם .
pH
.
ו ח ל ה ע ל י ה ה ד ר ג ה י ה ב ע צ מ ה ה צ ב ע ה צ ה ו ב של ה ה מ י ס ה .
הפרש ה ב ל י ע ו ת 0.79מ ת א י ם ל ־ ׳ 9 . 6ק ב ו צ ו ת
6מייל מ ה ת מ י ס ה ה א ל ק ל י ת ה מ ה ו ל ה
ה ד ו ג מ ה ה כ י ל ה 0.048
נ ו ס פ ו 10מייל ת מ י ס ת N NaOH0.2
ל א ה ר שעה ה ו צ א ו 0.5מייל מ ת ע ר ו ב ח ה ר י א ק צ י ה ו נ מ ה ל ו ל 1 0 -פ ״ ל עם
ל 3 -מייל מ ת מ י ס ה ז ו
ד ו ג מ ה של
הוהאם
נ ו ס פ ו ה ו ף בהישה פ ג נ ט י ת .
ד י א ל י ז ה נ ג ד ח ו מ צ ת ת ו פ ץ 0.1פ ו ל ר לפשך 12
נ ו ד ף עד יובש והשארית המוצקה מוצתה 3פעמים
דיניטרופנול.
לשארית
-
נ ו ס פ ו 10פ ״ ל
m u 4 0 8ש ה ג י ע ו לערך,
NaOH
- 115 -
5
מקסימלי של 0.91המתאים לריכוז של M ~7.10דיניטרותיופגולט( 60תור דקות.
מ״ל נלקחה להידרוליזה טוטלית ואנליזת חומצות אמיניות )ראה טבלה מסי .(12
0.055מיקרומול תלבון.
למול חלבון.
יובש.
יתרת תערובה הריאקציה הוהמצה עם 2.2מייל תומצת תומץ 0.5נורמל ונודפה עד
לאחר קירור ל 0^-נוסף לתמיסה 1מייל הומצה
פרפורמיח ,ולאחר שעתיים נודפה ההמיםה על ידי ליופילזציה.
^ ־ p Hהותאם ל— 11עם תמיסת NaOHמהולה.
מומסים ב 1-מייל כהל.
לשארית נוספו 10מייל מים,
לאתר 15דקות נוטרלה התמיסה עם חומצח חומץ
השארית הומסח ב 5-מייל חומצת הומץ
DADPA
75מ״ג
הדוגמה הכילה
כמות הדיניטרותיופנול שהשתהררה באלימינציה היתה איפוא 0.64מול
השארית הומםה ב 2-מייל חומצה פורמית.
ונודפה עד יובש.
דוגמה בת 0.5
2
.N
לדוגמה של 2מייל מההמיםה נוספו
התמיסה תוממה ל 50°-למשך שעה ואהר נודפה עד יובש.
השארית מוצתה 4פעמים עם 5מייל אתר ,ולאהר נידוף הומסה ב 3-מייל מים.
לאתר הוספת 50מ״ג
אשלגן ביקרבונט ,נוספו 0.2מייל של תמיסת 10$פלורודיניטרובנזן בכהל.
התערוכה נבחשה למשך
16שעות בטמפרטורה החדר.
לאחר ההמצה עם כמה טיפות תומצת מלת מרוכזת מוצתה התערובת עם 5־
מנות של 10מייל אתר ואהר נודפה עד יובש.
השארית הצהובה הומסה ב 3-מייל חומצת מלת 6נורמל,
והמבהנה נתתמה בואקום והוממה ל־־ 105°למשך 16שעות.
אתר.
ההמיסות האתריות צורפו ונודפו עד יובש.
הוזידרוליזט מוצה עם 4מנות של 5מ״ל
השארית עברה סולבילמציה במכשיר cold finger
בטמפרטורה של 80 - 100°בואקום גבוה למשך 12שעות ,להרתקת הניטרופנול.
ב 0.5-מ״יל אצטון.
השארית הומסה
לדוגמא של 0.2מייל נעשהה כרומטוגרפיה על רובד דק של סיליקה-גל.
המפהה היח תערובה של כלורופורם! כחלעמילי שלישוני :חומצה הומץ ) 70נ .(3 : 30
יהיד של
- Nדנימרופניל-הריאונין שמוצה לתוך 1פ״ל 1$אשלגן ביקדבונט.
של התמיסה ב[1 -ך 350היחח .0.31
ההידרוליזה ).(139
נמצא כתם
הצפיפות האוטטיח
ערך זה מתאים לניצולת של 0.3מול למול חלבון )לפי
אקסטינקציה מולרית של 15000והנהה הריסה של 10$של
הממס
- Nדיניטרופניל-תדיאונין בתנאי
-
הומצי
נשטף
) 5מייל ה ו מ צ ה ג פ ר ה י ת 6נ ו ר מ ל ב ל י ט ר א צ ם ו ן (
באצטון
הוצאה
ובמים,
ולאחר
להידרוליזה טוטליה
מיקרומול
הלבון.
ניםרופנול
ביקרבונט 1מולד,
ונודפה
עד
יובש.
בנםיון
בתנאים
של ה ה ל ב ו ן
ב-
ונודפה
הנ״ל.
0.1מייל מ ה ה ר ה י ף
ב.50°-
402
ל 2 . 3 -מ י ק ר ו מ ו ל של
ב א נ ל י ז ה קצה ב ש י ט ה
יובש.
m
נגזרת החלבון
0.1מייל מ ה ת ד ה י ף
לפי
ה א נ ל י ז ה 0.057 ,
20מייל ת מ י ס ה
.
.O.INNaOH
לאהר
ערך זה מתאים ל 1 9 . 2 -ק ב ו צ ו ה
נוספו
ה ה י ד ר ז י נ ו ל י ז ה לא נמצאו
המשקע
10מייל ת מ י ס ת א ש ל ג ן
חחמיםה נוטרלה
תומצות א מ י נ י ו ת
קיצוניות.
וניטרופנילאוקסי-קרבונילציה ל- N -אצטיל-ריבונוקליאזה
הנגזרת חחלבונית הכילה
pH
p
ד ו ג מ א של
הדוגמא הבילה,
נוספו
צנטריפוגציה.
ת ו ך שעה ה ש ת ח ר ר ו 84%פ ה ק ב ו צ ו ה ה נ י ט ר ו פ נ ו ל י ו ח .
א ה ד נעשה ה י ז ו ר
11.8
עד
ואנליזה חומצוה אמיניות.
0 . 9 4 .
למול חלבון.
ו ה ו פ ר ד ה על י ד י
ה ו מ ג נ צ י ה ה ו ר ה ף ב 1 0 -מייל מ י ם .
ל ד ו ג מ א א ה ד ת של
ת ה ה ב ל י ע ה ה א ו פ ט י ת של ה ה מ י ם ה ב -
הופסו
117
-
6.3ק ב ו צ ו ה
ניטרופנול לפול הלבון.
ו ה ו ך 15ד ק ו ה ה ל ש ה ד ו ר כ פ ו ת י של ה נ י ט ר ו פ נ ו ל .
ב א נ ל י ז ה קצה ב ש י ט ה
ה ה י ד ר ז י נ ו ל י ז ה נפצא
ו ל י ן בלבד,
1.8מ י ק ר ו מ ו ל
ההמיסה נוטרלה
ב נ י צ ו ל ת של
.22%
-
118
-
ק י צ ו ר י ם
4.2
-
SDNP
GSH
GSSG
2,2
N
-דיניטרופניל
S
גלוטתיון
מחוזר
ג ל ו ט ת י ו ן מחומצן
)-1דימתיל אמינו
DNS
דנסיל
Cbz
קרגובנזוקםי
- 5-םולפוניל(
- * D A D P Aדיאמינו-דיפנילאמין
Tyr
פירוביל
DPP
דיאיזופרופיל
פוספופלורידט
C0C1
0 pנ י ט ר ו פ נ י ל כלורופורמט -
כלוריד
C1
0PTCפנילתיוקדבוניל
-*5,5דיתיו-ביס
)-2ניטדובנזואיח(
DTNB
חומצח
DPNH
דיפוספופירידין
DCC
DMSO
דיציקלוהקסיל
ה
-קרבודיאימיד
דימחיל -סולפוקסיד
7 T Mו י ר ו ם
נ. .
-
נוקליאוטיד מחוזר
מ ו ז א י ק ה הטבק
נקודה היחוך
NBS
^ברומו-סוקצינאימיד
NBA
א-ברומו-אצטאמיד
LDH
ד ה י ד ר ו ג נ ז ה לקטיה
AC
אצטיל
ס
בעבודה
ציסטאין,
זו
נתקרו
כ
-
- 119
ו
ם
ו פ ו ת ח ו ש י ט ו ת ל ב ק ו ע כ י פ י של ש ר ש ר ו ת פ פ ט י ד י ו ת ל י ד י ש י י ר י
)דרך יצירה שייר ד ה י ד ר ו א ל נ י ן (
הן פהצד ה ק ר ב ו כ ם י ל י
ו ה ן פ ה צ ד ה א פ י נ י של ש י י ר
הציסטאין.
.1
ו ה ו ר ח ב ה שיטה פ צ י ו ר נ י ק
פוההה
3שלבים ע י ק ר י י ם :
)(1
אליפינציה;
)(2
ל ב י ק ו ע קשרי
וםוקולובסקי
הפיכת נגזרת הציסטאין
ציסטאיניל.
לשייר ד ה י ד ד ו א ל נ י ן
השיטה כ ו ל ל ת
באפצעות ריאקציה
ו
אפיד
ה-
ו ל -א -פ י ר ו ב י ל או
א -פ י ר ו ב י ל י ה או
םהקרנו
א.
זו התרכז
ציסטאין
ג.
הפעלת שיטת ה ה י ת ו ך ב ב ק ו ע ת ל ב ו נ י ם ש ו נ י ם .
לדהידרואלנין
בנוכתות שיירי
ציםטין.
א-פירוביל.
עיקרי הפמצאים.
ב ת נ א י ם בהם ע ו ב ר ת ק ב ו צ ת
ד י נ י ט ר ו ת י ו פ נ ו ל אליפינציה כמותית פתרכובות
) 30ד ק ו ת ב NaOH -
שיירי
ציםטין.
שיירי
דהידדואלנין,
0.1Nב ( 2 5 ° -
התופעה הודגפה
האלימינציה
ב ^ -־ א צ ט י ל ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה שבה
ת ו ך ה י ע ל מ ו ת מ ס פ ר ד ו מ ה של ש י י ר י ח צ י
ז ו ה ו על
ידי
-8דיניטרופניל.
האלימינציה
הפעלה שיטה ה ה י ת ו ך
נוצרו
ציסטין.
בהנאים הנ״ל כ3-
שיירי
ה צ י ס ט י ן בהם
ו א נ ל י ז ת קצה של ה ת ו צ ר .
י ו ה ר ל ט מ פ ר ט ו ר ה מאשר ז ו של ק ב ו צ ת
על י ד י הורדת טמפרטורת ה ר י א ק צ י ה ל ' 0 ° -נ י ת ן
של ק ב ו צ ו ת ד י ם ו ל פ י ד ב י ח ס ל ז ו של ק ב ו צ ו ת
-Nם ו קצי נ י ל -ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה .
-8דיניטרופניל-
ע ו ב ר ו ת א ל י מ י נ צ י ה ג ם ק ב ו צ ו ת ד י ס ו ל פ י ד י ו ת של
מ ה י ד ו ה ה א ל י מ י נ צ י ה של ק ב ו צ ו ת ד י ם ו ל פ י ד ר ג י ש ה
בנגזר וה
בהתאפה;
בעיקר בנושאים הבאים:
ב.
ארעה
פפטיד,
)(3
ניתוק הקבוצה
ה -ז < -ה י ד ר ו כ ם י פ י ר ו ב י ל י ת ת ו ך ה ש י פ ה ה ו פ צ ה א פ י נ י ת ק י צ ו נ י ת חדשה.
פ י ת ו ה שיטה פ ש ו פ ר ת ל ב י ק ו ע ק ב ו צ ו ת
ציסטאין
.2
בשיטה
-Nהידרוכסי-פירוביל
ת ק ר ב ע י ת ה ה פ י כ ה ה ס ל ק ט י ב י ת של ש י י ר י
להלן
.1
ב י ק ו ע ה י ד ר ו ל י ט י או
פ ח מ צ ן של ש י י ר ה ד ה י ד ר ו א ל נ י ן
לפפטיד
להקטין
-8דיניטרופניל,
ב 6 0 $ -אה מ ה י ר ו ת
כפי שהודגם
- 120ב ח י פ ו ש אתר
.3
נגזרה
אלה
12
ב-
נ ג ז ר ו ת ציםטאין שתעבורנה ריאקצית אלימינציה בתנאים יותר
ה - 8 -ד י נ י ט ר ו פ נ י ל נהקרו
נמצאה כמתאימה ל צ ר כ י
. p H
משקל
עם ז א ת נ מ צ א כ י
חמצון
י צ י ב ו ה ה של ק ב ו צ ת
אלימינציה ב-
לאחר
על י ד י
הללו
הומצה פ ר פ ו ר מ י ת ,
עוברות אלימינציה באלקלי.
נתרן
בורוהידריד מלווה
ו ס ו ל פ י ט ו ל י ז ה על
ב כ ך ש מ ה י ר ו ת ה ת ג ו ב ה של
ז ו של ה ת ג ו ב ה עם
יוני
קבוצות דיסולפיד.
נמצא כ י
אלקליים
נ פ ג ע י ם גם ש י י ר י ם
טירוזינית
חיתוך
קיום
נמצאו
בבקוע
ק ב ו צ ו ת הקצה ה צ פ ו י ו ת
ר י א ק צ י ו ה ב ה ן הלה פ ו ד י פ י ק צ י ח של ק ב ו צ ו ח
פוגעות בקבוצה ה - 8 -ד י נ י ט ר ו פ נ י ל ,
בתנאי
חלקי
אלימינציה.
, p H
ידי
יוני
אולם
טירוזיניים.
ה ט י ר ו ז י ן על
ידי
הקשר צ י ם ט א י נ י ל -ט י ר ו ז י ן
- Sאמינו-אהיל-ריבונוקליאזה.
ההברר כי
ציסטאין
נ ו כ ת ו ת עודף
ז ו ה ב י א ל מ צ י א ת ק ב ו צ ת קצה
נמצא כ י כ ל ה מ ו ד י -
ה ס ו ל פ י ט ו ל י ז ה נ ב ד ל ת משאר
S
-ד י נ י ט ר ו פ נ י ל קטנה
יותר
ה ב ד ל ז ה ע ש ו י לאפשר א ל י מ י נ צ י ה ס ל ק ט י ב י ה של
א -פ י ר ו ב י ל או
ש ה ו פ ע ת ה צ פ ו י ה ב ב ק ו ע קשרי
את ה מ צ ו ן
בדרך
ה ב י ק ו ע של ק ב ו צ ו ת
מ ו ד י פ י ק צ י ו ת אלה כ ל ל ו
ב-8-קרבוכסימתילציה,
סולפיט.
ס ו ל פ י ט עם ק ב ו צ ת
קבוצת - Sד י נ י ט ר ו פ נ י ל ב נ ו כ ח ו ה ק ב ו צ ו ה ד י ס ו ל פ י ד שעברו
.5
עובר
12
- Sד י נ י ט ר ו פ נ י ל בהנאי
ל נ ג ז ר ו ת טעונות שלילית שאינן
המודיפיקציוה
מאשר
ה א ל י מ י נ צ י ה של ק ב ו צ ה מ ל ו ו ה ב ר י א ק צ י ה ל ו א י שבה נ ו צ ר ב ש ו ו י
ב ע ז ר ת ה א ג נ ט י ם ס ו ל פ ה י ד ד י ל י י ם או
פיקציות
ודנםיל.
ש ב י ן .5 - 30%
דיסולפיד
חיזור
-8פיקריל
מבין
ה - 8 -פ י ק ר י ל העוברת אלימינציה
ק ו מ פ ל כ ס מ י י ז נ ה י י מ ר של ק ב ו צ ת ה - S -פ י ק ר י ל ש א י נ ו
בניצולות
.4
הקבוצות העוזבוח
אלימינציה סלקטיבית קבוצה
א-אצטיל-S-פיקריל-ריבונוקליאזה,
נבדקה
-Sסולפו,
מ ת ו נ י ם מאשר
סולפיטוליזה.
- Nה י ד ר ו כ ם י -פ י ר ו ב י ל על י ד י מי חמצן
זו
ה ס י ב ה ל א י מ צ י א ת ה של ק ב ו צ ת קצה
בריבונוקליאזה.
פ נ ו ל או
טירוזינית
הומצה
נמצא כ י
ניתן
למנוע באופן
?-הידרוכס׳'-|3-פנילפרופיונית.
ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה מ ב ו ק ע ת ב נ י צ ו ל ת של .10%
ב ר י ב ו נ ו ק ל י א ז ה א ו מ ת ג ם על
ידי
ע י כ ו ל ט ר י פ ט י של
^אצטיל-
- 121
-
פ ו ת ח ה ש י ט ה חדשה ל ב ק ו ע קשרי
בתנאים
)3-5
מתונים
מתרככות
^ פ י ר ו ב י ל ה מ ב ו ס ס ת על ה פ ע ל ת
, p Hטמפ'
50°
-
^ פ י ר ו ב י ל י ו ת ב נ י צ ו ל ו ת שבין
- ' 2 , 2ד י א ט י נ ו -ד י פ נ י ל א מי ן
,(25ת ו ך ש ת ד ו ר ה ק ב ו צ ו ת ה א מ י נ י ו ת ה ח פ ש י ו ת
.65
- 80$
CHo-CO-CO-NHR
J
0
מבנה
ת ו צ ר ה ה י ת ו ך ה ט ט ר ה -צ י ק ל י ה ו כ ה ב ע ז ר ת מ מ צ א י ם ם פ ק ט ר ל י י ם של א י נ פ ר א -א ד ו ם ; n . m . r . ,
וםפקטרום-מםה,
פפטידים
שיטת
ו כ ן על י ד י שימוש ב ק ב ו צ ה פ י ר ו ב י ל י ת מ ס ו מ נ ת ב -
מכילי
ציםטאין
- 70$
ב נ י צ ו ל ו ת כ ו ל ל ו ת של
ה ב י ק ו ע ה מ ש ו פ ר ת ה ו פ ע ל ה ב ה צ ל ת ה ב ב ק ו ע קשרי
כימוטריפסין
אמיניות
והלבון
ו י ר ו ם מ ו ז א י ק ה הטבק.
הקיצוניות הסמוכות לשיירי
המופיעים
בספרות.
ריאקציה
כתוצאה ממנה מ ו ב נ ם פהמן
השלבים הבאים:
בכל המקרים נמצאו
- 60$
או
הציסטאינות ובין
א ל ק ט ר ו פ י ל י לעמדה
אריל-היו-קרבונילית
ע ל ה ק ב ו צ ה ה ק ר ב ו נ י ל י ת של
תיאזולידינית;
לציסטאין.
התיו-קרבונט
)(3
pH
ה י ד ר ו ל י ז ה של הקשר
ת י ו כ ל ו ר ו פ ו ר מ ט י ם אשר
? של השרשרת ה צ ד ד י ת .
7
pH
השיטה כ ו ל ל ת את
עם - pנ י ס ר ו פ נ י ל -
י צ י ר ת ה נ ג ז ר ת ה א ר י ל -א ו ק ס י -ק ר ב ו נ י ל י ה או
) (2ה ת ק פ ה צ י ק ל י ה של
^ 8
.30
כ ל ו ר ו פ ו ר מ ט י ם או
פ נ י ל ת י ו -ק ר ב ו נ י ל כ ל ו ר י ד ,תוך
בהתאמה;
בתוצרי
הביקוע התומצות
^ א צ י ל -צ י ס ט א י ן ב ש ר ש ר ו ת פ פ ט י ד י ו ת ,ה מ ב ו ס ס ת על
) (1א צ י ל צ י ה של ה ק ב ו צ ה ה ם ו ל פ ה י ד ר י ל י ת ב -
כלורופורמט
הסמוכה
.25
ה צ י ם ט א י ן ב ה ת א ם ל מ ב נ י ם ה ר א ש ו נ י י ם של ה ה ל ב ו נ י ם
פ ו ה ה ה ש י ט ה ל ב י ק ו ע ס פ י צ י פ י של קשרי
בין
.0
הציםטאיניל בתלבונים ריבונוקליאזה,
ניצולות הביקוע בהלבונים היו
קבוצת התיאול
8ו
השיטה
נוצלה בבקוע
ח נ ק ן ה ק ש ר ה א מ י ד י של ה צ י ס ט א י ן
ב , 5 0 ° -ת ו ך י צ י ר ת טבעת
ה-ז-1אצילי,
-2קטו-3-אציל-
ת ו ך שתרור הקבוצה ה ק ר ב ו כ ם י ל י ת
-
-GO-NH-CH-CO«R
\
122
-
RCOC1
7
-CO-NH-CH-CO-
I
pH
>׳CH
2
I
SH
8
pH
CH-CO-
-CO-HN
\
CH
/
OC
־+ R
2
- CH-CO-
8
pH
2
OC
CH
+
-C0 H
2
R = 02NC H 0 ; C H S
5
בשיטה
זו
ב נ י צ ו ל ו ה של - 70%
לואי
6
4
6
נ ב ק ע ו ק ש ר י - Nא צ י ל -צ י ם ם א י ן ב ש ו ר ה של ת ר י פ פ ט י ד י ס מ כ י ל י
.30
ציםםאין,
י י ש ו ם ה ש י ט ה ל ת ל ב ו נ י ם נ ת ק ל ב ק ש י י ם ע ק ב ק י ו מ ן של ר י א ק צ י ו ת
ה נ ו ב ע ו ה מ א י -ה ט ל ק ט י ב י ו ה של
הכלורופורמטים.
- 123 -
R E F E R E N C E S
1.
H.A. Scheraga i n The Proteins (Ed. H. Neurath), V o l . 1, p. 477 (1963).
2.
C. Nolan and E. Margoliash, Ann. Revs. Biochem., 37, 727 (1968).
3.
G.H. Dixon,
4.
L. Stiyer,
5.
A. Light,
6.
R.P. Ambler,
־7
,,
Essays Biochem., 2 , 147 (1966)
Ann. Revs. Biochem. 37, 25 (1968).
Methods Enzymol. 11_, 426 (1967).
i b i d . JM, 436 (1967).
P. Edman, Acta Chem, Scand. 10, 761 (1956)
8.
־9
־
־
P. Edman, Ann. N.T. Acad. Sci., 88, 601 (1960).
W.A. Schroeder,
Methods Enzymol. JM_, 445 (1967).
10.
G.R. Stark, Biochem. 7, 1796 (1968).
11.
P. Edman and G. Begg, Europ. J . Biochem. 1_, 80 (1967).
12. (a) E. Lederer and B.C. Das, i n "Peptides", Proceedings of the 8th Europ.
Peptide Symp, Noordwijk, The Netherlands, 1966 (H.C. Beyerman,
A. van de Linde and V.M. van den Brink Eds.) pp. 131-154, North
Holland Publishing Co., Amsterdam 1967.
(b) H.M.
Shemyakin,
Pure Appl. Chem. 1J, 313 (1968).
(c) E. Lederer, i b i d . , 17, 489 (1968).
־13
D.G. Snyth,
Methods Enzymol. JM,, 214 (1967).
140
M.L. Ludwing and R. Byrne,
15.
R.F. Goldberger,
160
T.C. Merigan, V.J. Dreyer and A. Berger,
17.
A. Marzotto, P. Fajetta, L. Galzigna and E. Scoffone, Biochim. Biophys Acta
154. 450 (1968).
18.
P.J.G. Butler, J . I . Harris, B.S. H r t l e y and R. Leberman,
103. 78P (1967).
־19
J . Am. Chem. S o c , 84 , 4160 (1962).
Methods Enzymol.
JM,, 317 (1967).
a
H.A. Itano and A־J. Gotlieb,
Biochim. Biophys Acta, 62. 122(1962).
Biochem. J . ,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1j2, 405 (1963).
20.
H.A. Itano and E. Norris,
Abstr. 7th Int. Cong. Biochem., Tokyo, 595 (1967).
21.
J־A. Tankeelov, CD. Mitchell and T.H. Crawford, J . Am. Chem. Soc., 90.1664(1968).
- 124 ־22
K. Toi, E ־Bynum, E ־Norris and H.A. Itano, J . B i o l . Chem. 242. 1036 (1967).
23.
K. Nakaya, H. Horinishi and K. Shibata, J . Biochem. Tokyo, 61., 345 (1967).
24 (a) I . Levin, A. Berger and E. Katchalski, Biochem. J . 63, 308 (1956),
0
(b) P. Haurowitzj The Chemistry and Functions of Proteins, pp. 402-405, Acad.
Press, (1963).
25.
J.L. Bailey,
Techniques i n Protein Chemistry (2nd Ed.) pp. 141-151, Elsevier
Publishing Company, Amsterdam 1967.
26.
B. Vitkop, Advan. Protein Chem. JjS, 221 (1961).
־27
B ־Vitkop and L־K, Ramachandran, Metabolism, V3, 1016 (1964).
־28
B. Vitkop, Science, 162. 318 (1968).
־29
C. Zioudrou and G ־Schmir,
30־
־31
J ־Am. Chem ־S o c 1 9 6 3 )
3258
,85
G. Schmir and C ־Zioudrou, Biochem. 2 , 1305 (1963).
V. Avad and P־E ־Wilcox,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 17. 709 (1964).
32.
E. Gross, C.H. Plato, J.L ־Morell and B. Vitkop, Abstr. Am. Chem. Soc. 150th
Meeting, p. 65 (1965).
33.
E. Gross, J.L. Morell and P.Q. Lee, Ann . N.Y. Acad. S c i . , 151. 556 (1968).
־34 A. Patchornik, V.B. Lavs on, E. Gross and B, Vitkop, J . Am. Chem. S o c , 80 , 4748
(1958).
35 o
A. Patchornik, V B ־Lavs on E. Gross and B, Vitkop, J . Am. Chem. Soc. 80 , 4747
(1958).
36.
A. Patchornik, V.B ־Lawson, E. Gross and B. Vitkop, J . Am. Chem. Soc. 82, 5923
־
p
(I960).
37.
־38
L.K. Ramachandran and B. Vitkop, J . Am. Chem. Soc. 81., 4028 (1959).
T ־Peters Jr., Compt. Rend. Trav. Lab. Carlsberg. Ser. Chim. 31., 227 (1959)־
39־
I. Bermer and P ־Jollfes,
40.
G.L. Schmir, L.A. Cohen and B. Vitkop, J . Am. Chem. S o c , 81., 2228 (1958).
41.
G.L. Schmir and L־A ־Cohen,
־42
Compt. Rend. 253. 745 (1961).
J . Am. Chem. Soc.
83, 723 (1961).
E־J ־Corey and L.F ־Haefele, J . Am. Chem» Soc. 81., 2225 (1958).
43.
J.G. Vilson and L.A. Cohen, J . Am. Chem. Soc.
44.
J־G. Vilson and L.A. Cohen,
85, 564 (1963).
ibid, 85, 560 (1963).
,
- 125 ־45
S ־Shaltiel and A. P tchornik, J . Am. Chem. Soc.
־46
S. S h a l t i e l , Ph. D. Tresis.
־47
M. Vilcheck and A. Patchornik, J . Am. Chem. Soc־
a
48. M. Vilcheck,
85, 2799 (19 63).
The Hebrew University, Jerusalem (1964).
&t, 4613 (1965).
Ph. D. Thesis, Veizmann I s t i t u t e of Science, Rehovoth (1965).
n
49.
M. Funatsu, N.M. Green and B. Vitkop, J . Am. Chem. Soc.
50.
T. Burstein, M. Vilcheck and A. Patchornik,
51. M.Z. Atassi,
Arch. Biochem. Biophys
86, 1846 (1964).
Israel J . Chem., 5,, 65p (1967).
120. 56 (1967).
52. L.K. Ramachandran and B. Vitkop, Biochem. 3_, 1603 (1964).
53. A. Previero, M-A. C o l l e t i - Previero and CI. Axelrud-Cavadore,
Arch. Biochem. 122
434 (1967).
־54
T.E. Barman and D.E. Koshland, Jr., J . B i o l . Chem., 242. 5771 (1967).
550
־56
T. Spande, M. Vilcheck and B. Vitkop, J . Am. Chem. Soc. 90, 3256 (1968),
M. Vilcheck and B. Vitkop, Biochem. Biophys Res. Commun. 26, 296 (1967).
57. H. Iwasaki, L.A. Cohen and B. Vitkop, J . Am. Chem. Soc.
58.
־59
־61
־69
L.A. Cohen and L. Farber, Methods Enzymol. 1J., 299 (1967).
L. Farber and L־A ־Cohen,
60.
85, 3701 (1963).
S. Isoe and L.A. Cohen,
E. Gross,
1 0 2
Biochem. ,5,
7 (1966).
Arch. Biochem, Biophys, 127. 522 (1968).
Methods Enzymol. J l , 238 (1967).
62.
E. Gross and B ־Vitkop, J . Am. Chem. Soc. 83, 1510 (1961).
63.
G. Gross and B. Vitkop, J . B i o l . Chem. 237. 1856 (1962).
64.
S. Sasakawa,
65.
A.R. Battersby and J.J. Reynolds,
66.
T. Kaneko, J . Takeuchi and T, Inui,
67.
T. Kaneko and T. Inui, i b i d . 36, 1541 (1963).
68.
T. Kaneko, S. Kusumoto, T. Inui and T. Shiba, i b i d , 41_, 2155 (1968).
J . Biochem. Tokyo, J53, 188 (1963).
J.L. Vood and N ־Catsimpoolas^
J . Chem. Soc. 524 (1961).
B u l l . Chem. Soc. (Japan) 41., 974 (1968).
J . B i o l . Chem., 238. PC2887 (1963).
- 126 -
־70
N. Catsimpoolas and J.L. Vood, i b i d , 241_» 1790 (1966).
71.
M. Bergmann, E. Brand and F. Weimann,
־72
A־P ־P h i l l i p s and E. Baltzly,
־73
P. Desnuelle and G. Boujour,
־74
D.P. E l l i o t t ,
Biochem. J .
J . Am. Chem. Soc.
50, 542 (1952).
F. Lucas, J.T.B. Shaw and S.G. Smith,
76.
S. Sakakiba K.H. Shin and G.P. Hess,
78.
־79
i b i d , 66, 468 (1957).
J . Am. Chem. Soc.
?
J. Lenard and G.P. Hess,
K Iwai and T. Ando,
6<?, 200 (1947).
Biochim. Biophys Acta. 7, 451 (1951).
75.
־77
Z. physiol. Chem. 131. 1 (1923).
84, 4921 (1962).
J . B i o l . Chem. 239. 3275 (1964).
Methods. Enzymol.
11., 263 (1967),
T. Burstein, M. Fridkin and A. P tchornik, Israel J . Chem. 5.» 64 p. (1967).
a
80.
R.B. Martin, R. Hedrick and A. P a r c e l l ,
־81
E. Gross and J.L. Morell,
־82
T.C. Bruice and F.H. Marquardt,
־83
J. Schultz, H. A l l i s o n and M. Grice,
־84
J ־Schultz,
85־
־86
J . Org. Chem. 29, 159 (1964).
J . B i o l . Chem. 241. 3638 (1966).
Methods. Enzymol.
J . Am. Chem. S o c , 84, 365 (1962).
Biochem. 1., 694 (1962).
11_1967)
255
F. D'Angeli, V. Giormani, F. F i l i r a and C. Di Bello,
Commun.
88.
Tetr. Lett.
28, 809 (1967).
K־E ־Pfitzner and J.G. Moffat, J . Am. Chem. S c
0
85, 3027 (1963).
M. Morishita, F. Sakiyama and K, Narita,
־90
M. Morishita, T, Sowa, F. Sakiyama and K. Narita, i b i d .
־91
E. Bamberger and A. Berbe,
B u l l . Chem. S o c Japan,
40, 433 (1967),
40, 632 (1967).
Ann. 273, 347 (1893).
־92 A. Previerro, M. C o l l e t t i and L. Galzigna,
195 (1964).
94.
2475 (1966).
Biochem. Biophys. Res.
־89
־93
.
C־M ־Tsung and H. Fraenkel-Conrat, Biochem. 4, 793 (1965).
F ־D'Angeli, E ״Sccffone, F. F i l i r a and V. Giormani,
87.
)
״
Biochem. Biophys Res, Commun., 16.
M.A. Ruttenberg, Te Piao-King and L.C. Craig,
Biochem. 3_, 758 (1964).
M.A. Ruttenberg, Te-Piao-King and L.C. Craig,
i b i d , 4, 11 (1965).
־95
T. Kauffmann and J ־Sobel, Angew. Chem. 75, 1177 (1963); Int. Ed., 2 , 743(1963).
־96
T. Kauffmann and J . Sobel, Ann. 698. 238 (1966),
־97
A. Patchornik, M. Vilcheck and S. Sarid,
־98
A.J.
־99
M. Vilcheck, S. Sarid and A. Patchornik, Biochim. Biophys. Acta, 104. 616 (1965).
־100
C. Moroz, A. de Vries and M. Sela,
Birch, J . Cymerman-Craig and M. Slaytor,
101. V.F. Benisek and R.D. Cole,
־102
־114
J . Am. Chem. Soc.
86, 1457 (1964).
Aust. J . Chem. _8, 512 (1955).
i b i d . 124, 136 (1966).
Biochem. Biophys Res. Commun., 20, 655 (1965).
V.F. Benisek, M.A ־Raftery and R.D. Cole, Biochem. 6, 3780 (1967).
103. M. Sokolovsky, T. Sadeh and A. Patchornik, J . Am. Chem. Soc. 86, 1212 (1964).
104. I. Photaki, i b i d , 85, 1123 (1963).
105. A. Patchornik and M. Sokolovsky,
Proceedings of the 5th European Peptide Symposium
(Oxford 1962). Pergamon Press, p. 253 (1963).
106. G. Riley, J . Turnbull and V. Vilson,
J . Chem. Soc. 1373 (1957).
107. A. Patchornik and M ־Sokolovsky,
J . Am. Chem. Soc. 86, 1206 (1964).
108. A. Patchornik and M. Sokolovsky,
ibid, 86, 1859 (1964).
־109 D־H. Strumeyer, V. Vhite and D.E. Koshland, Jr., Proc. Natl. Acad. Sci., 50, 931,
(1963).
110. H. Veiner, V־N. Vhite, D.G. Hoare and D.E. Koshland, J r . , J . Am. Chem. S o c , 88.
3851 (1966).
111. L. Anderson and J.J. Kelley^
J . Am. Chem. S o c , 81., 2275 (1959).
112. A. Neuberger, A ־Gottschalk and R.D. Marshal, i n "Glycoproteins",(A.Gottschalk Ed.)
Elsevier Publishing Company (1966), Chapter 10, p. 273.
113. B. Anderson, P. Hoffman and K, Meyer,
Biochim, Biophys Acta, 74, 309 (1963).
R. Got, I . Goussault and J . Fout, Carbohydrate Res., 3 , 157 (1966),
115. T. Tanaka, M. Bertolini and V. Pigman,
Biochem. Biophys Res. Commun., VjT>57 (1964).
116. S ־Habron, G. Herman, B. Rossignol, P. Jolles and H. Clauser, Biochem. Biophys
Res ־Commun. J7, 57 (1964),
־117 Z ־Bohak and E. Katchalski^ International Symposium on Naturally Occuring
Phosphoric Esters (Newcastle upon T y n e ) 1967.
- 128
-
,
118. (a)P.D. Boyer, H. Lardy and K. tyrback, i n•The Enzymes**, Vol. 1, part IIj Academic
Press, Inc., New York (1959), p. 511.
(b) R. Cecil and J.R. McPhee, Adv. Protein Chem., J4, 255 (1959).
(c) M.O. Dayhoff and R.V. Eck,
Atlas of Protein Sequence and Structure 1967-68,
National Biomedical Research Foundation, Sliver Spring Md., 1968, p.59
119. P.D. Boyer,
Brookhaven Symposia i n Biology No. 13, pp. 1-25 (1960),
120.
H. Lindley,
Nature, 178, 647 (1956).
121.
M.A. Rafteiy and R.D. Cole, Biochem. Biophys. Res. Commun., W
122.
D.S. Tarbel and D.P. Harnish, Chem. Revs. 49, 1 (1951).
123.
J.M. Swan. Nature 179, 965 (1957).
124.
0. Gawron and G. Odstrchel,
125.
Z. Bohak, J . B i o l . Chem., 239. 2878 (1964).
126.
M. Sokolovsky and A. Patchornik, J . Am. Chem. S o c , 86, 1860 (1964),
127.
S. S h i f r i n , N.O. Kaplan and M. C i o t t i ,
128.
G.R. Stark and D.G. Sniyth,
129.
D. Cole, Methods Enzymol., 11., 315 (1967).
130.
B.G. Malmstrom and J.B. Neilands, Ann. Rev. Biochem., 33, 331 (1964),
131.
B.L. Valee and J.E. Coleman, i n Comprehensive Biochemistry** (M. Florkin
t
467 (1963).
J . Am. Chem. S o c , 82, 3263 (1967).
J . B i o l . Chem., 234. 1555 (1959).
J . B i o l . Chem. 238. 214 (1963).
,,
and E.H. Stotz Eds.) Elsevier, Amsterdam (1964), Vol. 12, Chap. 6.
132.
A.M. Gold,
133.
B.S. H r t l e y and V. Massey,
134.
D.T. Gibson ,״0J.M i l l e r and S. Smiles, J . Chem. S o c , J 2 J 1 9 2 5 )
135.
B.S. Saunders,
136.
D. Rittenberg and L. Panticorvo, Internat. J . Appl. Rad. and Isot., 1, 208
(1956).
F. Muth i n Houben-Veyls Methoden der organische Chemie (Ed. E. MUller) 4th Ed.,
Vol. 9, p. 586, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1955.
S. Smiles and D.T. Gibson, J . Chem. S C , 125. 176 (1924),
137.
138.
139•
Methods Enzymol., JM., 706 (1967).
a
Biochim. Biophys Acta. 21., 58 (1956),
Biochem. J . , 2£, 397 (1933).
0
J.L. Bailey, Techniques i n Protein Chemistry (2nd Ed.) Chap. 4, Elsevier
Publishing Company, Amsterdam, 1967.
1821
- 129 140.
M. Sokolovsky, Ph.D.
141.
H.P. Burchfield,
142.
S. S h a l t i e l ,
־143
Thesis, T^e Hebrew University, Jerusalem, 1963.
Nature, 181. 49 (1958),
Biochem. Biophys Res. Commun. 29, 178 (1967).
C.S. Price and S. Oae, Sulfur Bonding, The Ronald Press Company, 1962, p. 104.
144.
W.A. Pryor, Mechanism of Sulfur Reactions, McGraw-Hill, 1962, pp. 36-40.
145.
J.L. Bailey and R.D. Cole, J . B i o l . Chem. 234. 1733 (1959).
146.
W.H. McGregor and P.H. Carpenter,
147.
H.B.F. Dixon,
148.
R. Foster and C.A. Fyfe,
149.
E. Buncel, A.R, Norris and K.E. Russell,
150.
L.J. Bellamy, The Infra-red Spectra of Complex Molecules, John Wiley & Co.
Ltd. New York, Chaps. 12, 15 (1960),
151•
A.I. Brodskii, M־M. Aleksankin and I.P. Gragerov. Zhur Obschei Khim., 32,
829 (1962); J . Gen. Chem. USSR, 32, 823 (1962).
־152
Biochem. 1_, 53 (1962).
Biochem. J . 90, 26 (1964).
Rev. Pure and Appl. Chem. 16,, 61 (1966).
Quart. Revs. 22, 123 (1968).
S. Pinchas, D. SamuBl and M. Veiss-Broday, J . Chem. S o c , 1688 (1961).
153•
D. Chapman and P.D. Magnus, Introduction to Practical High Resolution
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Academic Press, London,
1966, Part I I .
154.
B.P. Dailey and J.M. Shoolery, J . Am. Chem. S o c , 77, 3977 (1955).
155.
N.S. Bhacca, D־P ־H o l l i s , L.F. Johnson and A.E. Pier. High Resolution
NMR Spectra Catalog,Varian Associates, Palo Alto California,
Vol. 2 (1963).
156.
S. Moore and V.H. Stein,
157.
I . Burstein and A. Patchornik, Israel J . Chem., 3 , 97 (1965).
158.
K. Randerath,
J . B i o l . Chem., 211. 907 (1954).
Thin Layer Chromatography, p 9 9
־, Academic Press, New York
(1963).
159.
D.E ־Faherney and A.M. Gold,
J . Am. Chem. Soc. 85., 997 (1963).
160•
B.V. Plapp, M.A. Raftery and R.D. Cole, J . B i o l . Chem. 242. 265 (1967).
161.
H.B.F. Dixon,
Biochem. J . 92, 661 (1964).
- 130 -
162. (a)B.S. Hartley,
Nature, 201. 1284 (1964).
(b)B.S. Hartley and D.L. Kauffman,
163.
Biochem. J . 101. 229 (1966),
H. Fraenkel-Conrat, i n The Proteins (Ed. H. Neurath) Vol. 3, p. 99,
Academic Press, New York (1965).
164.
H. Fraenkel-Conrat, Virology,
4, 1
(1957),
165.
G.L. Ellman,
166.
M.R. Crampton and V. Gold,
167.
S.C. Fu, F.E. Price and J.P. Greenstein, Arch. Biochem. Biophys, 31.,
168.
D. Swern, J . Am. Chem. S o c , 69, 1692 (1947).
169.
T. Severin and M. Adam, Chem. Ber. 96, 448 (1963).
170.
M. Sokolovsky, M. Wilcheck and A. Patchornik, J . Am, Chem. S o c , 86, 1202(1964).
171.
D. Ben-Ishai and A. Berger,
172.
H, Fraenkel-Conrat and CM. Tsung,
173.
J.A. Maclaren,
174.
H.B.F. Dixon and V. M ret,
175.
S. Van Heyningen and H.B.F. Dixon, i b i d . 104 . 63P (1967).
176.
D.G. Smyth, W.H. Stein and S. Moore,
177.
A. Eckert and K. Steiner,
178.
179.
T. Vieland, K.H. Shin and B, Heinke, Chem. Ber., 91., 483 (1958).
R.M. Herbst and D. Shemin, Organic Syntheses, C o l l . Vol. I I . Ed. A.H. Blatt,
John Wiley & Sons, Inc., New York, 1943, p. 591.
180.
A. Gilman, F.S. P h i l i p s , E.S. Koelle, R.P. Allen and E. St. John,
Arch. Biochem. Biophys., 82, 70 (1959).
J , Chem. Soc. B, 23 (1967).
8
3
(1951).
J . Org. Chem. V7, 1564 (1952).
Methods Enzymol., 11., 151 (1967),
Aust. J . Chem., 21., 1891 (1968).
Biochem. J .
0
94, 463 (1965).
J . B i o l , Chem., 238. 227 (1963).
Monatsh. 35, 1153 (1914).
Am. J . Physiol.
147. 115 (1946).
181.
G.W. Anderson and A.C. McGregor,
182.
H. Rivier,
־183
J . Am. Chem. S o c , 79, 6180 (1957).
B u l l . S o c Chim. France, fr] 1, 733 (1907).
A.M. Katz, W.J. Dreyer and C.B. Anfinsen, J ־B i o l , Chem. 234, 2897 (1959).
184.
D ־Morse and B.L. Horecker,
Anal. Biochem., _14, 429 (1966).
Modification a n d Cleavage of Peptides a n d Proteins
at Cysteine Residues
Thesis Submitted for the Degree
of
DOCTOR OF PHILOSOPHY
by
YA I R
DEGANI
Submitted to the Scientific C o u n c i l of the W e i z m a n n Institute of Science
Rehovot
N o v e m b e r 1969
Modification a n d Cleavage of Peptides a n d Proteins
at Cysteine Residues
Thesis Submitted for the Degree
of
DOCTOR OF PHILOSOPHY
by
YAIR
DEGANI
Submitted to the Scientific C o u n c i l of the W e i z m a n n Institute of Science
Rehovot
N o v e m b e r 1969
This work was carried out
at the Weizmann Institute of
Science under the supervision
of Professor Abraham Patchornik.
SUMMARY
Methods vere investigated and developed for the cleavage of peptide chains at
cysteinyl residues, both at the carboxyl function (via formation of a dehydroalanine)
and at the amino function of the cysteine residue.
I.
The method of Patchornik and Sokolovsky for the cleavage of cysteinyl bonds was
developed and extended.
The method consists of three main steps: (1) conversion of a
cysteine derivative into a dehydroalanine
residue by an elimination reaction ;
(2) hydrolytic or oxidative cleavage of the dehydroalanine
residue resulting i n the
formation of peptide amide and an N-pyruvoyl or N-hydroxypyruvoyl peptide, respectively;
(3) scission of the N-pyruvoyl or N-hydroxypyruvoyl group and liberation of a new
N-terminal amino acid.
The investigation of this method concentrated upon the following subjects:
a.
Studying the problem of selective conversion of cysteine residues into dehydro-
alanine residues i n the presence of cystine residues.
b.
Designing an improved method for the cleavage of N-pyruvoyl groups.
c.
Application of the method for cleavage of various proteins at cysteine residues.
י׳
The main findings are summarized below:
1.
Disulfide groups undergo elimination from cystine residues under the same condi—
tions (30 min. i n 0.1N NaOH at 25°) which promote quantitative elimination of dinitrothiophenolate from S-dinitrophenylcysteine compounds.
This was demonstrated on
N-acetyl-ribonuclease, i n which about 3 dehydroalanine
residues were formed under the
above conditions, while a similar number of half-cystine residues disappeared.
The
cystine residues at which elimination reaction took place were identified by employing
the cleavage method and subjecting the cleaved products to
N-terminal analysis.
II
2.
The elimination rate of disulfide groups i s more sensitive to temperature conditions
than that of S-dinitrophenyl groups.
Thus by lowering the reaction temperature to 0°,
the elimination rate of disulfide groups relative to that of S-dinitrophenyl groups
decreased by 60%, as demonstrated with N-succinyl-ribonuclease
3.
derivatives.
In search for cysteine derivatives containing leaving groups that would undergo
elimination reaction under milder conditions than those required for the
derivative, the S-sulfo, S-picryl and
dansyl groups were investigated.
S-dinitrophenyl
Of these the
S-piciyl group, which undergoes elimination at pH 12, was found suitable for selective
elimination.
The elimination i s however accompanied by a side reaction i n which a
Meisenheimer-type complex i s formed i n equilibrium with the S-picryl cysteine residue.
On cleaving N-acetyl-S-piciyl-ribonuclease, after elimination at pH 12, the expected
N-terminal amino acids were found i n 5-30%
4.
yield.
The s t a b i l i t y of the S-dinitrophenyl group was examined under reaction conditions
which modify disulfide groups to negatively charged derivatives which do not undergo
elimination i n a l k a l i .
These modifications included reduction by sulfhydxyl reagents
or sodium borohydride followed by S-carboxymethylation, oxidation by performic acid and
s u l f i t o l y s i s by s u l f i t e ions.
S-dinitrophenyl group.
A l l the modifying reagents were found to affect the
The rate of the reaction of s u l f i t e ions with the S-dinitro-
phenyl groups was found, however, to be slower than that of the reaction with disulfide
groups.
This difference may
enable selective elimination of S-dinitrophenyl groups i n
the presence of disulfide groups which have undergone prior s u l f i t o l y s i s .
5.
Tyrosine residues are oxidized by alkaline hydrogen peroxide which serves for
s p l i t t i n g N-pyruvoyl of N-hydroxypyruvoyl groups.
The f a i l u r e to detect N-terminal
tyrosine i n cieaved ribonuclease i s due to this reaction.
The oxidation of tyrosine
residues can be p a r t i a l l y prevented by the presence of phenol or p-hydroxy-^ -phenylpropionic acid.
Under these conditions an N-terminal tyrosine could be detected i n
Ill
cleaved ribonuclease i n 10$ y i e l d .
The presence of a cysteinyl-tyrosine sequence i n
ribonuclease was also confirmed by tryptic hydrolysis of N-acetyl-S-aminoethylribonuclease.
6.
A new method was developed f o r the cleavage of N-pyruvoyl groups. By treating
N-pyruvoyl compounds with 2,2'-diaminodiphenylamine
under mild conditions (pH 3-5,
temp. 25-50°) the free amino groups were liberated i n 65-80$.
The structure of the tetracyclic cleavage product was confirmed by infrared,
18
n.m.r. and mass spectroscopy, and by 0
labeling.
The method was used i n the cleavage
of cysteine-containing peptides i n overall yields ranging 25-70$.
־7
The improved method f o r cleavage at cysteinyl residues was succesfully applied to
ribonuclease, <^-chymo trypsin and tobacco mosaic virus protein .In a l l cases the cleavage
products contained the expected new N-terminal amino acids, originally adjacent to
cysteine residues i n accordance with the primary structures of the proteins reported
i n the literature cleavgae yields ranged from 30-60$.
II.
A method was developed for the specific cleavage of N-acylcysteine peptide bond,
based on a reaction between .the cystein t h i o l function and chloroformates or thiochloroformates, by which an electrophilic carbon i s introduced at the
position of the
amino acid side chain. The method consists of (1) acylation of the sulfhydiyl group
at pH 7 with p-nitrophenyl chloroformate or phenylthiocarbonyl chloride, to form the
IV
corresponding aryloxycarbonyl or arylthiocarbonyl derivative; (2) cyclic attack of the
cysteine N-amide nitrogen on the carbonyl fmiction of the thiocarbonate
group at pH 8,
50°, forming an 2-keto-3-acylthiazolidine ring; (3) spontaneous hydrolysis of the N-acyl
bond of the formed ring, liberating the free carboxylic group of the amino acid residue
adjacent to cysteines
RCOO.
•A
pH 7
-C0-NH-(jJH-C0-
-CO-NH-CH-COR
^
\
־יין
SH
pH 8
HN
~C0 H
2
+
/
0C
CH-CO-
-CO-HN
\
CH-CO-
/
pH 8
CH.
\
OC
R
02
־־NC H 0
6
4
;
CHo
+ R"
CHS
6
5
Several cysteine-containing tripeptides were cleaved by this method i n 30-70%
yields.
Application of the method to the cleavage of proteins i s complicated by the
existance of side reactions due to the non-selectivity of the chloroformates.
© Copyright 2025