Analysering av HbA1c med kromatografisk metode
BFI 03. februar 2015 v/ Gro Nielsen (AHUS)
Hva er HbA1c?
• Normalt hemoglobin består av 2 alfakjeder og 2 bettakjeder
• Glykosylert hemoglobin (HbA1c) er et glykoprotein dannet ved en
irreversibel reaksjon mellom glukose og betakjeden i
hemoglobinet.
• Verdien reflekterer det gjennomsnittlige blodglukosenivået de
siste 6-10 ukene før prøvetaking.
• HbA1c avhenger av normal levetid for erytrocyttene. Nedsatt
levetid gir falsk for lave resultater.
2
1
Changes in globin expression during embryonic,
fetal and adult life
α-chain
β-chain
γ-chain
22
22
22
HbA1
HbA2
HbF
δ-chain
0
-6 months
Birth
6 months
3
HbA1c – diagnostisk test
Kriterier:
• HbA1c > 6,5 %
• Fastende glukose >7,0 mmol/L (hvis ikke HbA1c kan benyttes)
• 2 timers venøs glukose etter 75 g oral glukose >11,1 mmol/L.
4
2
Instrument - TOSOH G8
5
HbA1c på AHUS
• Antall prøver pr. døgn: ca 250 (PHT + interne).
• Analysetid: 1,6 min. pr prøve.
Analysering fra kl 08:00 til ca 16:00
• Prøvemateriale: 1 mL EDTA-blod (primærrør)
70µL EDTA-blod i analysekopp
• Holdbarhet: 7 dager (2-8 °C)
5 dager (romtemp.)
• Referanseområde: 4,0 – 6,0 % (oppgitt av leverandør, verifisert)
6
3
Prinsipp – Kromatografi (HPLC)
HPLC (high performance liquid chromatography)
• Høyt trykks væskekromatografi med ionebytting.
• Stasjonær fase – kolonne ”pakket” med kationer.
• Mobil fase - 3 elueringsbuffere, med ulik pH og ionestyrke.
• Gode separasjonsegenskaper oppnås med kolonne pakket med
svært små partikler og en høytrykkspumpe som pumper den
mobile fasen gjennom systemet.
7
Analysering av prøver
Prøvemengde
4µL blod fortynnes automatisk med hemolyse/ vaskeløsning (1:200) og
hemolysatet sendes inn i kolonnen (via forfilteret).
Mobil fase
Elueringsbufferne sendes deretter inn i kolonnen, en etter en, slik at de ulike
hemoglobinfraksjonene separeres.
8
4
Normalt HbA1c- kromatogram
økende
bindingsstyrke
9
Når byttes kolonnene?
Kolonnene lever ikke evig og må byttes ved behov:
• For høyt kolonnetrykk
• QC problemer
• For lav teoretisk plateverdi (TP-verdi<250), dvs butte topper.
10
5
Rutiner ved kolonnebytter
• Kalibrerer ny kolonne
• Analyserer kvalitetskontroll
• Analyserer minst 10 pasientprøver med gammel og ny kolonne
(korrelasjon). Passing & Bablok regresjon.
• Evt reanalyse av nedfrosset materiale fra tidligere ekstern
kvalitetsvurdering eller andre nedfrosne ”arkivprøver”
11
Analysekvalitet - presisjon
• CVa (langtidsCV):
HbA1c nivå ca 6 %: CVa= 0,7 %. Kontrollmateriale, EDTA-blod
HbA1c nivå ca 9 %: CVa= 1,0 %. Kommersiell kontroll, liquid.
Kontrollmaterialene er uavhengige, dvs ikke fra
instrumentleverandør.
• Tillatt total feil: TEa = 3 - 4 %
12
6
Analysekvalitet - riktighet
Ekstern kvalitetsvurdering (Noklus)
• Små avvik med ny kalibrator. Bias ca +2 %.
Ingen faktorisering på AHUS.
• Biaskrav +/- 2,3 % ved kolonnebytter.
• Små kolonnelot-variasjoner.
13
Ekstern kvalitetsvurdering
Noklus, 4-2014
antall
%
Eget
resultat
Eget resultat:5,85% Avvik fra tillagt verdi: +2,5 %.
Akseptgrense: +/- 7%.
14
7
Atypiske kromatogram
• Gammel prøve
Ny prøve
ønskes
15
Hemoglobinopatier
• Syntesesvikt
Thalassemier (β og α)
• Mutasjoner i kjedene
Ulike varianter (D, S, C og E)
16
8
Thalassemi vs hemoglobinvariant
β - globinkjede
α - globinkjede
Normal
β-thalassemi
α-thalassemi
Hb-variant
17
Forekomst av hemoglobinopatier
(Etnisk norske har ingen)
Talassemier
HbD
HbC
HbS
HbE
18
9
Hemoglobinopatier- varianter
Sannsynlig D-variant
Svar kan
gis ut
med
tillegg:
Funn av
variant
19
Hemoglobinopatier- varianter
Sannsynlig S- variant
Svar
kan gis
ut med
tillegg:
Funn
av
variant
20
10
Hemoglobinopatier- varianter
Sannsynlig E- variant
Tillegg til
svaret:
Utført på
alternativ
metode.
Funn av
variant.
21
Hemoglobinopatier- føtalt hemoglobin (↑)
Økt mengde HbF (lite barn)
Svar
kan gis
ut.
HbF=
<15 %
22
11
Hemoglobinopatier- Thalassemi
β- Thalassemi minor:
Diabetes.
Nedsatt levetid på
RBC?
Svar
kan
ikke
rapport
eres
Hb,MCV, MCH,
RDW ??
23
Hb-typing. Normalt kromatogram
HbA0
HbF
HbA2
24
12
Oppsummering:
Brukervennlig instrument. Stabilt
Ujevn levetid på kolonnene
Lite vedlikehold
Positiv bias over tid (jmfr ERL).
Noe mindre med ny kalibrator.
God presisjon.
Liten lot til lot variasjon på
kolonnene
Mindre kapasitet enn
immunologiske metoder (?)
”Ser” hva vi analyserer.
Usikkert resultat?
En del kommunikasjonsproblemer
mellom TOSOH G8 og LIS
Oppdager hemoglobinopatier.
Videre analyse, med kolonne for
dette, gjøres ved behov.
25
13